如何验证正确的基因编辑并确保未发生针对目标基因的意外编辑事件
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基因组编辑在研究、医疗保健和农业方面有着强大的应用。然而，基因组编辑可能导致的各种分子反应事件的范围被低估了，而且该技术在目标位点内外仍然wu法预测。这对于为治疗性基因编辑、农业和其他应用提供安quan方法具有相当大的影响。预测和验证基因组编辑的结果对于锁有应用的成功至关重要。
Cas9 诱导的双链断裂导致一系列预期和意外的结果。zui终的编辑结果导致小的插入、删除或染色体易位或不完整的模板整合。
通过各种努力，我们已经采用了多种方法来验证正确的基因编辑并确保未发生针对目标的意外编辑事件。zui常用的分子方法是通过 Sanger直接DNA 测序或 PCR扩增子的 NGS ，其大小通常小于 1000 bp。
其他常见方法包括 T7核酸内切酶1 (T7E1) 错配检测分析、通过分解跟踪插入缺失 (TIDE) 分析和通过扩增子分析 (IDAA) 检测插入缺失、克隆 PCR 扩增子然后测序，但偶尔也包括quan基因组测序(WGS)、阵列比较基因组杂交 (CGH)、Southern 印迹、Fiber-FISH 和 FISH。
大多数情况下，这些方法仅提供有关基因编辑位点周围有限区域的信息，不会捕获来自 CRISPR/Cas诱变效应的整个序列，尤其是不会检测更大的缺失。为此Kosicki 等人在Nat. Biotechnol上发表的《Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements》论文，强调了将分子分析扩展到包括 CRISPR-Cas9 诱导的 DSB 位点周围的几千碱基的重要性，并展示了长读长测序如何可以高分辨率的分析基因编辑的准确性。
在这里，我们也推荐一种新的间接序列捕获技术 (Samplix Xdrop?) 的应用，用于富集长基因组DNA 片段，以通过长读长和短读长测序分析 CRISPR-Cas9 编辑细胞中的基因型和等位基因状态 。该论文名为《Verification of CRISPR editing and finding transgenic inserts by Xdrop Indirect sequence capture followed by short- and long- read sequencing》。
该研究中，研究人员通过Xdrop技术在一组 CRISPR 修饰的诱导多能干 (iPS) 细胞系中检测到 CRISPR-Cas9 诱导的意外基因编辑。 尽管使用其他几种互补方法进行了quan面分析，但早期验证 CRISPR 编辑的尝试并未检测到这些意外编辑。
在这项研究中，他们还证明用于评估 CRISPR-Cas9 基因组编辑事件的基于 PCR 的标准程序wu法提供足够准确的验证。CRISPR 编辑的验证应基于对更大区域的检查。
Xdrop方法所检测序列的位置可能与主要感兴趣区域（如基因编辑位点）相距 5-10 千碱基 (kb) 或更远。
其实验过程是在将高分子量 (HMW) DNA 、PCR 试剂和引物分配到双乳液液滴内并进行反应后，含有目标 DNA 的液滴通过液滴 PCR识别，然后用 DNA 嵌入荧光染料进行染色。
只有含有来自感兴趣区域 (ROI) 的 DNA 的液滴才会产生检测序列扩增子并发出荧光。由于双乳液液滴的大小和组成，这些可以在标准流式细胞仪细胞分选仪上进行分类，以富集荧光液滴。
然后分离含有长 DNA 片段的液滴，并通过液滴中的单分子多重置换扩增(dMDA) 进行扩增。dMDA 的扩增能力能够从 6 pg 的输入 DNA 中产生约 1.5 μg 的扩增 DNA，并且对大于 5 kb 的分子zui有效。由此产生的富集 DNA 与短读长和长读长测序平台兼容。
Xdrop间接序列捕获方法可采用距基因编辑位点 5–10 kb 或更远的距离设计的引物，它在高深度测序提供了大约 100 kb 长的区域的序列读取覆盖。这允许对基因编辑站点周围区域中潜在的意外编辑进行彻底调查。Xdrop技术展示了如何在事先不了解其基因组整合的情况下也能够识别转基因插入位点。
如果您想索取对各种基因编辑验证比较的综述论文，以及想对Samplix的Xdrop高保真基因扩增和验证技术有更多的了解，请联系我们的产品经理陈工，他的邮箱是chenbaohua@bio-goods.com或微信13060393900。
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