3D单细胞数字图谱分析系统，3D单细胞数字图谱研究时空组织结构测量分析系统

三维（3D）几何模型不仅是定量表征复杂组织的强大工具，而且对探测组织中的结构-功能关系也很有用。然而，由于同时获取多个（>4）荧光通道的实验限制，这些模型通常是不完整的。事实上，肝脏的预测几何和功能模型仅限于少数组织和细胞成分，不包括重要的细胞群体，如肝星状细胞（HSC）和库普弗细胞（KCs）。在这里，我们进行了深层组织免疫染色、多光子显微镜、深度学习技术和3D图像处理，以计算扩展同时重建的组织结构的数量。然后，我们生成了肝脏结构的时空单细胞图谱（），包括小鼠出生后发育不同阶段的所有主要组织和细胞成分。我们使用定量研究了1）从出生后早期发育到成年的肝脏形态动力学，以及2）KCs在小鼠肝脏稳态中的结构作用。除了对胆管和正弦网络重塑的完整描述外，我们的分析还发现了非实质细胞和肝细胞在大小、细胞核数量和DNA含量方面不同的出乎意料的时空模式。令人惊讶的是，我们发现KCs的特异性耗竭改变了HSC的数量和形态。这些发现揭示了肝脏异质性的新特征，并对肝脏组织的结构组织及其功能具有重要意义。该3D单细胞图谱是了解生理和病理条件下肝组织结构的有力工具。

介绍：

肝脏具有广泛的功能，包括新陈代谢、解毒、蛋白质合成和产生有助于消化的生化物质。这些不同的功能依赖于复杂的3D组织结构，不同的细胞类型以协调的方式共存和相互作用，因此，对细胞的确切空间位置进行三角测量是理解其作用的关键。从宏观上看，肝脏由称为小叶的功能解剖单元组成，小叶包括位于中央静脉（CV）和门三联体（肝动脉、门静脉（PV）和胆管）之间的细胞和组织结构。来自肠道、胰腺和脾脏的血液通过PV进入肝脏，并与来自肝动脉的血液混合。然后，血液通过一个称为血窦的高度分支的血管网络流向CV，而胆汁则以反平行的方向流经二个胆管（BC）网络。中央静脉和门静脉之间的空间主要由肝细胞和非实质细胞填充。肝细胞是肝功能核心的原代细胞类型，负责处理血液和向BC分泌胆汁。它们被“夹”在正弦内皮细胞之间，并与多个相邻的肝细胞共享顶端表面，形成3D BC网络。这种组织允许肝细胞与血窦和BC网络进行多次接触，以大限度地交换分子（1）。非实质细胞在肝功能和生长调节中也发挥着重要作用。它们包括肝窦内皮细胞、肝星状细胞（HSC）和库普弗细胞（KC）。HSC位于窦和肝细胞之间的Disse间隙，储存维生素A，并分泌大部分细胞外基质（2）。事实上，HSC的激活是几种肝病的核心驱动因素（2）。KCs是位于正弦毛细血管内的肝脏特异性自我更新常驻巨噬细胞，在启动肝脏免疫反应和清除循环内毒素方面发挥重要作用（3）。越来越多的证据表明，肝细胞、HSC和内皮细胞密切接触，从而形成所谓的“肝生态位。因此，整合在生态位内的任何细胞的功能变化终都可能影响其邻域，这并不奇怪。

经典组织学在理解肝脏组织结构方面起着至关重要的作用。它简单、通用，而且容易上手。然而，该技术也存在几个缺点，1）它不是定量的，2）忽略了3D信息，3）区分非实质细胞差，以及4）一些组织结构不可见，例如BC网络。组织清除、高分辨率荧光显微镜和3D图像分析的发展使3D肝组织重建能够以几何模型的形式进行，以前所未有的细节描述肝组织结构。在过去的几年里，几何模型已经被证明是游戏规则的改变者，并阐明了肝组织组织的基本原理。一些主要发现包括：i）肝细胞基于其倍性表现出明显的空间分带，ii）胆汁动力学的一个预测模型，iii）肝细胞性表现出液晶顺序，iv）肝部分切除术后的肝再生需要生物力学生长控制，和v）非酒精性脂肪肝患者的人类肝脏活检的3D重建显示3D BC网络中存在严重的拓扑缺陷，导致分带性微胆汁淤积。

到目前为止，荧光显微镜通常被限制为多四个荧光标记。由于这一限制，3D几何模型无法同时描述所有主要细胞类型和组织结构，从而忽略了肝生态位的组织。同时重建所有重要的组织网络（BC和血窦）、细胞（肝细胞、HSC和KCs）和亚细胞成分（细胞核）需要至少六种不同的标记物，因此不可能同时观察到所有感兴趣的结构，该系统结合了深层组织免疫染色、光学清除、多光子显微镜、深度学习技术和3D图像处理，虚拟地扩展了标记物的数量，并生成了肝组织的时空3D单细胞图谱。我们使用来描述出生后早期发育过程中的形态学变化以及KCs在肝组织结构中的结构作用。该图谱提供了一个强大的工具来定量描述每种细胞类型、其空间组织及其可能的交叉相互作用。将有助于识别肝脏结构的（亚）结构特征，为了解肝脏生物学和病理学提供前所未有的定量工具。