新型紧凑型细胞沉降器

我们现在已经开发出这种成熟技术的更紧凑、更高效的放大版本，并为其中四种新颖的设计申请了专利。

使用这些更高效、更紧凑的设计，经过验证的强大倾斜沉降器技术现在也可以适用于从重组微生物酵母细胞中生产治疗性蛋白质。

这张照片显示了一个实验室/中试规模的细胞保留装置（左侧）连接到一个 5 升生物反应器，在高细胞密度灌注操作中连续培养酵母毕赤酵母细胞数周。

所示的较小装置（右侧）预计可从 5 升哺乳动物细胞灌注生物反应器培养物中产生约 5 vvd 澄清的收获流，其中仅包含死细胞和细胞碎片以及分泌产物。

我们正在申请专利的内部沉降表面使其成为一个强大和紧凑的细胞分离装置，通过收获流选择性地去除死细胞和细胞碎片，并将活细胞和生产细胞完回收回灌注生物反应器。

使用新型 Compact Cell Settler 原型对酵母细胞进行灌注生物反应器培养

我们在新设计的新型紧凑型细胞沉降器中大大增加了倾斜沉降器表面，其占地面积与 CS-10 相同。

因此，我们能够以超过 5 升/天的更高灌注流速从生长酵母毕赤酵母细胞的 5 升灌注生物反应器中获得澄清的收获，超过哺乳动物细胞培养物中每天 1 体积交换的典型灌注率。

如图所示，生物反应器 OD600 保持在 700 以上超过 2 个月。生物反应器 OD 从 200 小时到 1000 小时的小波动是由于我们对灌注速率和进料甘油浓度的操作。

沉降器顶部流出物或收获物澄清，其 OD600 大多在 10 和 30 之间，代表生物反应器中酵母细胞的不到 5%。

基于更大尺寸的 CHO 细胞，预计这种相同尺寸的沉降器（直径 12 英寸，如上一页底部照片所示）每天能够从哺乳动物细胞中获得超过 250 升的澄清收获物。

与重复补料分批培养相比，从灌注生物反应器中收获的产品更高

在开始灌注之前的初始补料分批操作期间，分泌的蛋白质产物在生物反应器中积累至 >1.5 g/L 的滴度。灌注开始后，生物反应器中的蛋白质滴度由于

连续收获到流出物中并被新鲜培养基稀释而降低。

从 200 小时到 1000 小时，蛋白质滴度保持相对恒定，而灌注率大约为 2 升/天左右。随着灌注率在灌注生物反应器运行的两个月内逐渐增加，特别是在 1000 小时后，

由于收获和稀释率增加，蛋白质滴度略有下降。

然而，与较低灌注率下的早期值相比，收获罐中蛋白质积累的速率（灌注率和蛋白质滴度的产物）在较高灌注率下增加得更快。在两个月长的灌注操作中，

从这个以逐渐增加的灌注速率操作的 5 升生物反应器中积累的蛋白质收获量为 160 g。

这个数量比在相同的两个月期间从相同的 5 升生物反应器中进行大约 8 次重复补料分批培养操作的澄清上清液中收获的数量高出 4 倍以上。

Compact Cell Settlers 更适用于哺乳动物细胞的高细胞密度灌注生物反应器培养

不锈钢紧凑型细胞沉降器可用于在哺乳动物（例如 CHO）细胞的连续灌注培养中实现高细胞密度和高活力。在这张照片中，我们展示了一个典型的 6 

英寸直径紧凑型沉降器与连续灌注生物反应器的连接，该反应器用于培养 CHO 细胞超过两周。由于哺乳动物细胞大于 10 微米，并且比酵母细胞大，因此我们需要比酵母细胞更小的紧凑型定居器。

来自生物反应器的细胞培养液通过蠕动泵通过水平端口（隐藏在前景中带有 Sudhin Biopharma Co. 徽标的不锈钢沉降器后面）泵入沉降器中。沉降的 CHO 

细胞通过蠕动泵从底部端口返回到生物反应器中。沉降器顶部端口的流量只是蠕动泵控制的两个流量之间的差异：1. 来自生物反应器的入口流量和 2. 从沉降器到生物反应器的返回流量。

可以从沉降器顶部流出流和沉降器底部返回流中取样，以测量每个流中的细胞浓度和活力。我们还可以测量这两个样品以及生物反应器中细胞的大小分布，

以分析紧凑型细胞沉降器在选择性地仅去除沉降器顶部流出物中的死细胞和细胞碎片方面的性能。

紧凑型细胞沉淀器选择性地去除沉淀器顶部流出物中较小的死细胞和细胞碎片，但不会去除较大的活细胞。

在我们早期的哺乳动物细胞生物反应器实验之一中，由于使用了有毒的消泡剂，我们在生物反应器中的细胞活力较低 (~50%)。由于生物反应器中的这种低细胞活力，

我们取样并测量了生物反应器样品中细胞的大小分布。我们可以在 8 到 10 微米的尺寸范围内看到可识别的死细胞峰，以及较小尺寸范围内的大细胞碎片尾巴。

当这种低活力细胞被泵入 6 英寸直径的紧凑型细胞沉降器时，沉降器顶部流出物仅包含那些未在沉降器内沉降并在底部端口移除的细胞。

来自沉降器顶部流出物流的样品显示尺寸范围为 8 – 10 微米的较大死细胞峰和较小尺寸范围内的细胞碎片尾部。这些数据有力地表明，

我们的紧凑型细胞沉降器只能选择性地去除较小的死细胞和细胞碎片。更重要的是，顶部流出物含有少的 15-30 微米尺寸范围内的活细胞。

这种选择性去除死细胞和细胞碎片是我们的紧凑型细胞沉降器（以及我们之前的倾斜层状沉降器）的特之处，这是其他任何细胞保留设备所没有的，

例如那些使用膜、离心机或声学共振的设备诱捕方法。现在，凭借我们正在申请专利的紧凑型细胞沉降器，我们提供了与倾斜沉降器相同的选择性去除死细胞的方法，

而且占地面积小得多（1/6）。

紧凑型沉降器作为哺乳动物 (CHO) 细胞灌注生物反应器培养的选择性细胞保留装置可实现高细胞密度

在我们随后的哺乳动物细胞实验中，我们在生物反应器运行的两周内，使用紧凑型细胞沉降器作为连接到生物反应器的选择性细胞保留装置，以相对大约 500 毫升/天的低灌注流量。

由于通过沉降器顶部流出物流选择性去除死细胞和细胞碎片，生物反应器中细胞的存活率百分比保持高，或从十天内的约 80% 的值显着增加到两周内的约 90%。

在前两周补料页面培养物中存活率百分比的典型下降是单调的，或者由于补料分批生物反应器中死细胞的积累而根本无法逆转。

随着培养持续时间延长到三周，我们的灌注生物反应器的存活率百分比观察到增加是使用沉降器（紧凑型或倾斜型）作为选择性细胞保留装置的一个特特征，

但在任何其他使用膜的总细胞保留装置中没有看到、离心机或声学捕获室。

选择性去除沉降器顶部流出物中的死细胞和细胞碎片，几乎完将活细胞从沉降器底部返回到生物反应器

三个流的尺寸分布测量，1. 从生物反应器到沉降器的入口流，2. 沉降器顶部流出物/收获流和 3. 沉降器底部返回生物反应器可重复地表明 (a) 

沉降器顶部流出物或收获流包含只有死细胞和细胞碎片，但不含任何活细胞和生产细胞，并且 (b) 沉降器底部回流包含几乎所有从生物反应器进入沉降器的活细胞和生产细胞。

来自台盼蓝排除测定的其他数据（此处未显示）证实，沉降器底部回流中的细胞活力通常与生物反应器中的细胞活力相同，并且通常略高于生物反应器入口流中的细胞活力。

此外，留在沉降器顶部流出物中的细胞的活力低，证实大部分死细胞和细胞碎片留在流出物/收获流中。与生物反应器和沉降器底部回流中的活细胞数量相比，

收获流中的死细胞和细胞碎片数量大大减少（数个对数）。