| 产品名称 | quan内相关资料 |
| 品牌 | |
| 产品货号 | quan内相关资料 |
| 产品价格 | 现货询价 |
| 联系人 | |
| 联系电话 | |
| 产品说明
介绍荧光显微术是生命科学中的一套基本技术，用于可视化生命系统中的结构。通常，合成的或生物的荧光分子与生物样品中感兴趣的结构相关联。当用适当波长的光照射样品以激发荧光团时，分子发射光子，使得感兴趣的分子可见。荧光分子可以被可视化的分辨率很大程度上取决于样品的制备和所使用的物镜，但这可能受到焦平面中收集的失焦光的限制。 quan内反射荧光显微镜(TIRF)利用特定的光学器件在载玻片界面产生仅50-100纳米范围的照明光，大大减少了离焦光，提高了检测荧光分子的能力。由于其低光强和高空间分辨率，它是活细胞成像的关键技术。 落射荧光与TIRF显微镜在传统的落射荧光显微镜中，照明光通过物镜聚焦，激发样品中的荧光分子。由此产生的发射光子被相同的物镜收集并聚焦到科学相机上进行检测。这使样品暴露于过量的和离焦的光中，这增加了被成像细胞的有效光剂量。光本身以及在荧光过程中释放的自由基对细胞是有毒的，并导致样品降解。此外，焦平面外的荧光会增加图像中的噪声，降低整体信噪比和空间分辨率。TIRF通过照明方式的不同改善了这两个因素(图1)。  图1:表达网格蛋白轻链GFP的HeLa细胞的落射荧光和TIRF光照的比较。这些图像是在同一个焦点上拍摄的。左边的落射荧光照明产生更多的离焦光，表现为细胞质中的漫射信号。 对吧TIRF照明通过仅在表面100纳米内产生光学截面而产生更高的信噪比。 比例尺:10 μm。改编自Mattheyses以及其他人(2010). 在TIRF显微术中，激发光不像在落射荧光显微术中那样来自聚焦物镜，而是来自倾斜角度的光源，该光源可以穿过物镜或不穿过物镜。这提供了仅样品zui表面~100纳米的有效照明，大大提高了轴向分辨率(横向分辨率仍受衍射限制)。对细胞的总光剂量被zui小化，减少了光毒性效应，并消除了离焦荧光，给出了高得多的信噪比。 TIRF原则当穿过介质的光碰到具有不同折射率的介质时，一些光将被反射，一些光将被透射。相对比例取决于入射角的差异等。如果光从相对较高的折射率传播到较低的折射率，将会有一个角度，超过这个角度的光都会被反射。这是临界角(θC ),由斯内尔定律定义: θ?=sin?1(n1/n2)
其中n1和n2分别是介质的折射率。 当光超过临界角到达界面时，它被wanquan反射，这被称为quan内反射(TIR)。在TIRF显微镜中，通过物镜或使用棱镜，超过该临界角的光被呈现到载玻片-样品界面。这在界面上产生一个电磁场，称为倏逝场或波(图2)。 倏逝波的波长与TIR期间反射的光的波长相同，但呈指数衰减，导致样品中非常表面的荧光激发。传播波，如在落射荧光显微镜中使用的光，不会以这种方式衰减，导致较厚体积的受激样品。与其他荧光显微技术一样，可以使用物镜聚焦光线和分色镜分离激发和发射波长来检测TIRF荧光。  图2:传播波和倏逝波的照明差异。传播波，例如源自标准落射荧光照明的波，以线性方式通过组织传播，并且可以激发1/3-1毫米深度的荧光团。由TIRF产生的倏逝波呈指数衰减，并且在深度上仅具有高达~100纳米的强度。
TIRF光路TIRF的光路可以有多种方式，但两种主要方法是:通过物镜耦合照明和检测，以及使用棱镜分离照明和检测(图3)。 基于目标的TIRF 这里，像许多荧光显微镜一样，激发光和发射光通过一个物镜。对于TIRF，通过物镜的光路必须精度校准，以使离开光学系统的光在超过临界角时到达相同的位置。 这是通过使激光光源离轴进入物镜的后光瞳来实现的。离开透镜的入射角与离轴输入光的范围相关。高数值孔径透镜(%3E1.4 NA)对于从透镜获得足够的倾斜角以超过临界角并产生quan内反射(TIR)是必要的。基于目标的TIRF的好处是发射发生在界面上，因此没有组织或材料将发射的光扭曲回目标，基于目标的TIRF收集更多的光。然而，调整照明的角度比其他方法更困难，并且操纵倏逝场的自由度更小。 TIRF透镜 由于具有客观照明的TIRF的特殊性质，已经开发了特殊的透镜来促进TIRF显微术。这些具有1.49-1.7的非常高的数值孔径(分别为60倍和100倍)，这导致zui高的入射角和zui浅的倏逝场。考虑到活细胞成像中使用的温度升高(从23°C升至37°C ),一个常见的特征是一个校正环，用于补偿随温度变化的浸油折射率。这防止了由折射率不匹配引起的球面像差。 透过棱镜看TIRF 实现TIRF的其他方法是通过将光源从物镜上解耦，并通过在样品和载玻片之间的界面上使用一组棱镜来产生足够倾斜的光。物镜通常位于样品的另一侧，以容纳所需的额外硬件。这种设置的好处是易于调整光束和光线角度。倾斜角越大，倏逝场的穿透越深，光学截面越厚。然而，样品的厚度是一个问题，因为它位于激发光和物镜之间。这zui好用薄的、透明的或清澈的样品来完成，以避免发射光散射。 基于棱镜的TIRF系统的优点是照明光路可以被引导，从而根本不会进入物镜。光路可以更自由、更容易地操作，以优化入射角和激光对准等参数。信噪比也会显著增加。移除照明光的发射滤光器可以从物镜光路中移除。滤光器的存在降低了信号，因为光子在穿过透镜时总是丢失，并且照明光对噪声信号有贡献。 在TIRF的弱光应用中，例如单分子成像，已经开发了可以结合基于棱镜的系统的信噪比优势和基于物镜的TIRF的zui小光散射的技术。例如，在固定物镜和样品之间或在物镜后孔径之后使用宽带微镜，以将照明光反射出发射路径。这可以大大提高信噪比。  图3:与落射荧光照明相比的TIRF光路示例。在基于objective0和prism 0的TIRF中，样品中产生了一个倏逝场。对于基于物镜0的TIRF，倾斜反射光来自使用高数值孔径TIRF透镜通过物镜投射的光源。基于prism 0的TIRF在样品的另一侧使用棱镜，这里是梯形，不需要特殊的物镜。
TIRF显微镜应用活细胞成像可以ji大地受益于倏逝场的非常薄的光学部分。相反，这意味着在培养的细胞中只能在细胞膜上或细胞膜附近进行研究。由于这个原因，配体-受体结合、蛋白-膜运输、突触小泡融合和细胞粘附蛋白已经在培养细胞中用TIRF显微镜进行了广泛的研究，以及膜附近的其他事件，如丝状体中的肌动蛋白动力学和G-蛋白偶联受体转导事件。亮度的降低和低光毒性允许多次曝光而不影响样品的健康，这是长时间延时研究或快速、高时间分辨率成像的里想选择。 烦躁 TIRF已经与弗斯特共振能量转移(FRET)结合使用，用于荧光团之间相互作用时的动态成像。这可以发生在复合物中的不同分子之间，也可以发生在单个分子的不同区域。FRET以2-10nm的分辨率产生关于荧光团接近度的信息。它通常被解释为供体和受体之间相对荧光的变化。因此，它对噪声非常敏感，并ji大地受益于TIRF提供的更高的信噪比。这对于单分子FRET等弱光FRET应用尤为重要。 TIRF和超分辨率显微镜(SIM、PALM、STORM) 2006年，TIRF与结构照明显微镜(SIM)成功结合，进一步提高了TIRF的横向分辨率，达到约90纳米的超分辨率距离(图4)。使用相位和频率信息的SIM的增加也提供了深度信息，从而实现了具有高横向和轴向分辨率的3D成像。  图4:表达LifeAct GFP的cos 7细胞中TIRF活细胞成像与SIM TIRF的比较。左边的表达荧光肌动蛋白。对吧相同视场的SIM TIRF，通过从相位和频率数据计算空间信息来提高横向分辨率和对比度。 比例尺:3 μm。改编自Young以及其他人(2016). 另一个关键的改进是TIRF复色多色成像。这很困难，原因有二。shou先，对齐多个照明路径以在同一点提供TIRF是有问题的。弟二，倏逝波取决于光的波长，因此相同角度的不同波长产生不同的相对激发光量，使得解释困难。这现在是通过各种空间波调制器和光声调制器来塑造光路来实现的。超分辨率TIRF，包括使用多个光通道的模拟TIRF，现在已经成为常规。 TIRF还与随机光学重建显微术(STORM)和光激活定位显微术(PALM)结合使用，这两种技术依赖于计算单个荧光团分子的空间分布，以高精度去卷积它们在空间中的位置。这些技术使用TIRF在非常浅的光学部分获得高信噪比，提高定位精度。 纺纱点TIRF TIRF的进一步改进来自于操纵TIRF本身，而不是通过额外的加工。旋转光斑TIRF是对基于物镜的TIRF的改进，在基于物镜的中，从透镜后焦平面的外围进入的激光以环形绕后焦平面的圆周旋转(图5)。光束的旋转速度快于一帧的曝光时间，而不是来自单个角度的照明，有效地平均了来自径向位置的照明，产生了均匀的光斑。然后，旋转照明将实地的不一致性平均化，产生比传统TIRF更清晰、信噪比更高的图像。它与常规TIRF一样，可以与上述其他方法结合使用。  图5:使用旋转点TIRF提高信号均匀性。落射荧光、单点TIRF和旋转点TIRF照明之间的比较。左边的在落射荧光下，表达用EGFP标记的微管蛋白的COS细胞，中间标准TIRF和对吧旋转点TIRF照明。 比例尺:30 μm。改编自Ellefsen以及其他人(2015). 给TIRF的相机TIRF显微镜的应用多种多样，包括低光和高光应用。然而，通常高空间分辨率和/或快速实时成像是使用TIRF显微镜的动机。 使用高数值孔径镜头实现TIRF的技术必要性，加上对高空间分辨率的强调，意味着TIRF用户需要一台具有适当尺寸像素的相机，用于在衍射受限分辨率下进行奈奎斯特采样，同时对弱光单分子荧光应用足够敏感。 灵敏度通常是TIRF成像的弟一考虑因素，背照式、95%量子效率的sCMOS和EMCCD传感器是典型的选择。为了实现衍射ji限分辨率，下一个问题是使像素大小与所用的放大倍数相匹配。大约10-11微米的像素大小对于100倍镜头来说是zui佳的，而大约6-7微米的像素大小对于60倍镜头来说是zui佳的，这两种都是sCMOS相机的常见像素大小。EMCCD相机通常具有较大的13或16微米像素，分别需要120倍或150倍的放大倍数。 对于某些TIRF应用来说，大的传感器面积也很重要。sCMOS传感器通常比EMCCD大，其中zui常见的em CCD具有11 mm的对角线视场，而sCMOS传感器的范围往往从18 mm到32 mm，以更好地利用现代的大视场显微镜。 对于高时间分辨率应用，如蛋白质动力学或受体运输成像，与EMCCDs相比，sCMOS摄像机可以通过更少的区域裁剪实现更快的帧速率，从而将高速与大视野结合起来。 摘要TIRF显微镜依靠quan内反射产生的倏逝场，在表面和样品之间的界面激发非常浅的3C100 nm光学部分。由于其出色的轴向分辨率和低总亮度，它已成为活细胞和单分子成像中的突出技术。结合其他方法，如FRET和超分辨率技术，它被广泛用于回答生命科学中的问题。
TIRF显微镜使用quan内反射现象来降低背景噪声。只有离盖玻片200 nm的样品薄层被激发，因此实际上发射的荧光团都在焦点上，背景信号显著降低。这个想法在20世纪50年代shou次被考虑，但直到20世纪80年代，由于密歇根大学的丹尼尔·阿克塞尔罗德的工作，这项技术才开始流行。
TIRF(quan内反射荧光)只激发200 nm层分子表面的荧光团，所以其他荧光团不被激发，不发光。结果，背景噪声显著降低。这一改进意味着TIRF已成为研究单分子的另先技术。
它适用于结构精细、厚度小于200纳米且靠近盖玻片的样品。这种类型的成像对于研究附着在表面或膜上的分子也是里想的。此外，它可以用来研究细胞质膜下的细胞质区。
quan内反射荧光(TIRF)显微镜是一种仅照亮表面附近的染料分子的技术。在这个视频中，TIRF显微镜的先驱描述了这项技术的用途，解释了倏逝波的原理，给出了许多在TIRF使用的不同显微镜配置的例子，并展示了偏振光TIRF如何用于成像膜的方向。 问题
quan内反射荧光(通常缩写为TIRF)显微镜是一种成像方法，其在样本的浅区域照射荧光，以提高信噪比。这种技术广泛应用于小结构或分子的成像。
凯勒·福斯特| Shutterstock TIRF显微术的方法论在TIRF显微术中，荧光分子存在于靠近高折射率固体(通常是盖玻片)的含水环境中的样品中。在所谓的临界角，照明是wanquan反射玻璃和液体之间的界面。这种反射产生了一种称为倏逝波的薄电磁场。 倏逝波激发玻璃盖玻片100-200 nm内的荧光团。这种薄场很重要，原因有三:信号与背景的比率很高，收集到的失焦荧光很少，zui后，细胞暴露的光比传统的显微镜技术少得多。 TIRF显微镜的基本应用TIRF显微镜zui初是在20世纪80年代发展起来的，但是直到zui近才被广泛使用。早期，TIRF被用于研究细胞和人类皮肤成纤维细胞基质的接触面积，以及生物医学表面动力学和细胞内能量转移的研究。 TIRF显微镜的主要用途与细胞膜有关，因为这是主要成像的区域。因此，TIRF显微镜可以用来记录配体介导的受体内吞作用的行为，以及受体沿细胞膜的横向运动。在这种情况下，受体通常使用荧光标记的配体、抗体或小分子进行成像。TIRF显微术也被用于研究胞吐作用和胞吞作用。荧光染料或蛋白质可以嵌入囊泡的货物中，这使得在胞吐过程中跟踪囊泡的运动成为可能。 TIRF显微术也同样应用于胞吞作用，帮助确定了Rab3A和Rab27A等蛋白质的作用，表明这两种蛋白质以协同方式调节囊泡与膜的对接步骤。还显示了Rab3A如何在胞吐期间从囊泡中解离。 通过倏逝场激发荧光团对于较厚的细胞如哺乳动物细胞非常有用。哺乳动物细胞也含有天然存在的荧光团，如黄素和NADH。通过TIRF显微镜获得的薄切片确保这种天然存在的荧光团不会被显著激发。这有助于提高高信噪比。 这种类型的光学切片使得TIRF显微术对于在细胞表面和基质之间的界面处成像分子和特征是里想的，例如病灶粘连、分泌小泡以及早期内吞颗粒。
quan内反射荧光显微术
TIRF能应用于神经科学吗？TIRF显微镜限于对发生在样本和盖玻片之间的界面处或附近的结构和过程进行成像。然而，有几个重要的应用，其中细胞表面附近的问题需要彻底研究，如神经科学问题。 神经元突触处神经递质的释放和摄取以前已经通过可以被认为是间接的方式进行了研究，例如遗传学和电子显微镜方法。 另一方面，TIRF显微镜提供了动态过程的直接视觉成像，如神经元中的蛋白质和囊泡相互作用。例如，研究已经显示了含有脂质的囊泡从活动区的释放，以及囊泡从离质膜20纳米远的储备池的运输以取代释放的囊泡。 复杂的用途和注意事项2011年，这种方法的进一步发展导致细胞内部更深层特征的更好成像。产生倏逝波的quan内反射通常发生在样本和盖玻片之间的界面处，但是该界面可以位于样本中更深的位置。 产生倏逝波的基础是两个表面(样品和玻璃)需要具有不同的折射率。如果具有不同折射率的介质之间的界面出现在样品中，则可以在细胞中更深处进行成像。例如，植物细胞中的质膜可以进行这种成像。 另一个类似的概念可能发生，被称为“沮丧的TIRF”。其中，在盖玻片和样本之间的界面处产生的场将光传播到弟二界面。该界面位于倏逝场内。 如果样品中的折射率处于某一值，则可以产生受抑TIRF。令人欣慰的是，沮丧的TIRF可以从界面反射的光束明显变弱来区别于正常的TIRF。 | |
世联博研（北京）科技有限公司 京ICP备19044772号-1
单位地址：北京市昌平区建材西路87号2号楼9层2单元906 | |
