高致病性猪蓝耳病病毒(PRRSV-M)核酸扩增检测试剂盒

 

【名称】                                                                    

中文名：高致病性猪蓝耳病病毒(PRRSV-M)核酸扩增检测试剂盒

英文名：Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome virus type universal Polymerase Chain Reaction (PCR) Diagnostic Kit

 

【目的】

本试剂盒适用于检测猪肺、淋巴结、血清等标本中高致病性猪蓝耳病病毒(PRRSV-M)mRNA，适用于猪蓝耳病病毒感染的辅助诊断。其检测结果仅供参考。

 

【原理】

本试剂盒采用快速提取高致病性猪蓝耳病病毒RNA，经过逆转录作用生成cDNA，用一对猪蓝耳病病毒特异性通用引物，配以一步法定性Buffer(内含Mg²+、Tris-HCl等)、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过一步法体外扩增法对猪蓝耳病病毒RNA进行扩增，从而达到快速检测之目的。

 

【试剂组成】

名      称	数      量	规      格
RNA提取液A	1   瓶	10ml/瓶
RNA提取液B	1   瓶	10ml/瓶
逆转录酶系	1   管	40μl/管
Taq酶系	1   管	40μl/管
PRRSV-M PCR MIX	1   管	800μl/管
PRRSV-M阳性质控品	1   管	100μl/管
阴性质控品	1   管	250μl/管

 

【储存条件】打开包装后RNA提取液A、RNA提取液B  4℃保存；其余-20℃保存，避免反复冻融。自备75%乙醇。

 

【试剂规格及有效期】40头份/盒，有效期12个月。

 

【标本采集】

1. 适用标本类型：猪肺、淋巴结、血清或其他组织等

2. 标本采集：

猪肺、淋巴结   无菌条件下取猪肺、淋巴结或其他组织等100mg左右，置入1.5ml洁净EP管，立即送检。

血清   用一次性无菌注射器抽取受检猪耳静脉或者前腔静脉静脉血2-5ml，静置斜放待血清析出， 1,0000rpm离心3分钟，可取上清立即用于测试；或吸取上部血清(约200μl)转入无菌1.5ml Eppendoff管，保存待检。

3. 标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。标本运送采用0℃冰壶。

 

【保存和运输】上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃。但不能超过6个月，标本运送应采用0℃冰壶。

 

【适用仪器】取得资格认证的定性PCR仪。

 

【使用方法】

1．RNA提取

1.1样品处理

固体组织：取0.5g左右组织用玻璃匀浆器匀浆或剪刀剪碎，加入1.5ml生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5ml的EP管中，10000rpm离心2min。取上清100μl于1.5ml的EP管中，加入200μl RNA提取液A充分震荡，静置3min。

血清或病毒液：取100μl血清加入200μl RNA提取液A充分震荡，静置3min。

阴性质控品：处理：取100μl阴性质控品加入200μl RNA提取液A充分震荡，静置3min。

1.2.加入200μl RNA提取液B，用力震荡15s，4℃ 13,000rpm离心5min。

1.3.弃上清，加入1ml 75%乙醇，充分混匀，13,000rpm离心5min，小心吸去大部分残留液体。

1.4.将提取管敞口在室温空气中干燥10min，使液体挥发干净，用20μl DEPC水溶解沉淀。

PRRSV-M阳性质控品：直接取3μl进行PCR扩增。

 

2．PCR扩增

从试剂盒中取出PRRSV-M PCR MIX、Taq酶系、逆转录酶系室温融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10s。

设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10,000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入22μl，向每管中加入处理后样品(所获得的RNA样品)或PRRSV-M阳性质控品和阴性质控品3μl，10,000rpm瞬时离心30秒。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阴性质控品，阳性质控品以及未知标本，按照下列条件扩增：

循环条件：42℃→20分钟，后94℃→2分钟， 93℃ 30s→58℃ 30s→72℃ 30s ，共35个循环。

 

3．电泳检测

4.1 2%琼脂糖凝胶配制：稀释50×TAE至1×TAE(取20ml50×TAE，加980 ml双蒸水至1L)，称4g琼脂糖放于500mL 锥形瓶中，1×TAE 200 ml,置入微波炉中加热熔解(避免加热沸腾溶液外溢)，再加入20μl 溴化乙锭(EB)充分混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后使用。

4.2 电泳检测：取PCR 扩增产物10μl，用加样枪点样于琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm 电压，1×TAE中电泳，紫外灯下观察结果。

 

4. 结果判断

在阴性质控品无带出现(引物带除外)，PRRSV-M阳性质控品出现180bp 扩增带时，实验结果成立。若被检样品出现180bp 扩增带为高致病性猪蓝耳病病毒阳性，否则为阴性。

 

【注意事项】

1. 使用前请仔细阅读说明书。并且严格按照说明书进行操作。

2. 试剂盒内各种组分使用前应充分融化混匀并经高速短暂离心后试用。

3. 所有使用的离心管、 Tip 头应用DEPC水处理并高压灭菌