人或各种动物骨髓单个核细胞分离液试剂盒

规格：3×100ml/kit

保存：室温避光储存，有效期至少2年。

试剂盒内容：

全血及组织稀释液 100ml

细胞洗涤液 100ml

试剂C 100ml

试剂E 100ml

试剂F 100ml

说明书 1 份

一、各种动物骨髓细胞的采集方法

1. 大鼠、小鼠骨髓的采集：用颈椎脱臼法处死动物，剥离出胸骨或股骨，用注射器吸取少量的F 液，冲洗出胸骨或股骨中全部骨髓液，以500g（约1800 转/分）离心20 分钟，弃上清。沉淀以F 液重复洗涤一次后用含20%胎牛血清的全血及组织稀释液悬起（细胞浓度为2×108-1×109个/ml），备用。

2. 大动物骨髓的采集：

A．骨髓穿刺点定位

（1）胸骨：穿刺部位在胸骨中线,胸骨体与胸骨柄连接处，或选胸骨上1/3 部。

（2）胫骨：穿刺部位在胫骨内侧,胫骨上端的下方1 厘米处。

（3）肋骨：穿刺部位在第5～7 肋骨各自的中点上。

（4）髁骨：穿刺部位在髁前上棘后2～3 厘米的髁嵴。

（5）股骨：穿刺部位在股骨内侧面,靠下端的凹面处。

B．骨髓穿刺方法

（1）实验动物按要求固定，穿刺部位去毛、消毒、麻醉，要求局部麻醉范围直达骨膜，也可作全麻。

（2）操作人员带消毒手套，确定穿刺点，估计从皮肤到骨髓的距离并依此固定骨髓穿刺针长度。左手拇、食指绷紧穿刺点周围皮肤，右手持穿刺针在穿刺点垂直进针，小弧度左右旋转钻入，当有落空感时表示针尖已进入骨髓腔。用左手固定穿刺针，右手抽出针芯，连接注射器缓慢抽吸骨髓组织，当注射器内抽到少许骨髓时立即停止抽吸，收集骨髓细胞加入4-5ml F 液混匀，以500g（约1800 转/分）离心20 分钟，弃上清，沉淀以F 液重复洗涤两次后用含20%胎牛血清的全血及组织稀释液悬起（细胞浓度为2×108-1×109 个/ml），备用。

（3）左手压住穿刺点周围皮肤，迅速拔出穿刺针，用棉球压迫数分钟。如穿刺的是肋骨，除压迫止血外，还需胶布封贴穿刺点，防止发生气胸。

3. 人骨髓的采集：

临床方法收集骨髓细胞加入4-5ml F液混匀，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃上清，沉淀以F液重复洗涤两次后用含20%胎牛血清的全血及组织稀释液悬起（细胞浓度为2×108-1×109个/ml），备用。

二、骨髓淋巴细胞分离方法

1．取1ml 骨髓细胞悬液与E液按1:1比例混合再与1份全血及组织稀释液混匀置20℃-30℃下自然沉降20-30

分钟。吸取浑浊的上清部分，弃去底部红细胞备用。

2. 取浑浊的上清部分液体小心叠加在C 液之液面上（比例为1：1），20℃±2℃，400g（约1500 转/分），离心20 分钟（半径15cm 水平转子）。

此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层;为稀释液层。第二层；为环状乳白色含所需单个核细胞层。第三层；为透明分离液层。第四层；为极少红细胞层。收集第二层细胞放入含细胞洗涤液4-5 毫升的试管中，充分混匀后，以500g（约1800 转/分）离心20 分钟。沉淀经反复洗涤2 次即得所需单个核细胞。

注： 提取率约为80%。

分离图例：

三、注意事项

A． 本分离液是敏光型的，在运输和贮藏过程中应在18℃-25℃避光保存，启封后置4℃保存避免微生物污染。另外，本品为真空包装，未启封前置于10℃ 以下易出现白色结晶，影响分离效果。

B． 待分离的骨髓要求新鲜，避免冷冻和冷藏。分离液和所分离样本一定在20℃水浴箱中复温20 分钟保证分离液和所分离样本温度在20℃±2℃时分离效果最好，且所有操作过程一定要在无菌条件下进行。

C． 由于各品牌离心机的性能不同，国内南北地区温度环境和四季的差异，可能影响分离效果，用户可以调节离心转数，调节离心的时间，摸索最佳的分离条件（具体分离条件各实验室自定）。

D． 最好使用无静电反应的离心管，推荐使用未经过碱处理的玻璃离心管。

四、产品性能指标

pH 7.0-7.5

渗透压 280-340mOsmol/kg

内毒素 ≤0.5EU/ml

无菌 直接接种培养14 天后培养基澄清

澄明度及不溶性颗粒物 每50ml 溶液中含10μm 以上的不溶性微粒20 粒以下，

含25μm 以上的不溶性微粒5 粒以下

五、贮藏及保存期限

18℃-25℃避光保存，有效期两年。启封后置4℃保存，有效期一周。

注：若保证无微生物污染，启封后可置4℃长期保存。但应注意保存温度较低时本分离液易出现白色结晶，

影响分离效果。