英文名称： human Tumor Necrosis Factor Alpha (TNFa) ELISA Kit
试剂级别： 分析纯
96T 仅供体外研究使用，不用于临床诊断!
人肿瘤坏死因子α(TNFα)ELISA试剂盒
本试剂盒运用双抗体夹心ELISA法定量测定人血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清液和其他生物液体中人肿瘤坏死因子α(TNFα)含量。
检测范围
15.625-1000pg/mL此检测范围仅供参考,可根据您的要求定做.
最低检测限
5.6pg/mL
实验原理
本酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒运用采用双抗体夹心ELISA法。用抗人肿瘤坏死因子α(TNFα)抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的人肿瘤坏死因子α(TNFα)与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人肿瘤坏死因子α(TNFα)抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗人肿瘤坏死因子α(TNFα)抗体与结合在包被抗体上的人肿瘤坏死因子α(TNFα)结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，人肿瘤坏死因子α(TNFα)浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中人肿瘤坏死因子α(TNFα)的浓度。具体参照各指标试剂盒相应的使用说明书。
试剂盒内容
| 试剂名称 | 数量 | 试剂名称 | 数量 |
| 96孔板(预包被) | 1 | 96孔板覆膜 | 2 |
| 标准品 | 0.5ml×1 | 标准品稀释液 | 1.5ml×1瓶 |
| 显色剂A液 | 6ml×1瓶 | 样品稀释液 | 6ml×1瓶 |
| 显色剂B液 | 6ml×1瓶 | 终止液 | 6ml×1瓶 |
| 酶标试剂 | 6ml×1瓶 | 密封袋 | 1 |
| 浓洗涤液(30×) | 1×20mL | 使用说明书 | 1 |
人肿瘤坏死因子α(TNFα)ELISA试剂盒需自备的设备及试剂
1. 450±10nm滤光片的酶标仪(建议仪器使用前提前预热)
2. 单道或多道微量加液器及吸头
3. 稀释样品的EP管
4. 蒸馏水或去离子水
5. 吸水纸
6. 盛放洗液的容器
试剂盒的储存及有效期
1. 未开封的试剂盒：所有试剂均按试剂瓶标签上所示保存。请注意，收到试剂盒后请尽快将TMB 洗涤液，终止液保存于4℃，其他试剂保存于-20℃。
2. 使用后的试剂盒：剩余试剂仍需按照试剂瓶标签所示的温度保存，开封后的酶标板要加干燥剂后密封保存于-20℃，避免潮湿。
注意：
试剂盒内酶标条可拆卸，按实验需求可分多次使用；使用后的剩余试剂盒建议在首次实验后 1个月内使用完毕。产品过期时间以盒子上的标签为准，保质期内所有组分都确保是稳定的。
人肿瘤坏死因子α(TNFα)ELISA试剂盒标本的采集与保存
1. 血清：
将收集于血清分离管的全血标本在室温放置 2 小时或 4oC 过夜，然后 1000×g 离心 20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20oC 或-80oC 保存，但应避免反复冻融。
2. 血浆：
用 EDTA 或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的 30 分钟内于 2-8oC 1000×g 离心 15 分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20oC或-80oC 保存，但应避免反复冻融。
3. 组织匀浆：
1） 取适量组织块，于预冷PBS（0.01mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，称重后备用（组织块较大需先剪碎后再匀浆）；
2） 可同时选用多种匀浆方法达到较好的破碎效果：首先将组织块移入玻璃匀浆器，加入5-10mL 预冷PBS 进行充分研磨，该过程需在冰上进行（有条件实验室可选用机器匀浆）；得到的匀浆液可再利用超声破碎或反复冻融 进一步处理（超声破碎过程中注意冰浴降温；反复冻融法可重复2次）。
3） 将制备好的匀浆液于5000×g 离心5 分钟，留取上清即可检测。
4. 细胞裂解液：
1）贴壁细胞需要先用胰酶消化，离心收集细胞（悬浮细胞可直接离心收集）；
2）将收集到的细胞用冷PBS 洗3 次；
3）物理方法裂解细胞（可先超声破碎细胞，再反复冻融）：
i 超声破碎：取适量PBS 重悬细胞，用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂。
ii 反复冻融：将待破碎的细胞在-20 oC 以下冰冻，室温融解，反复3 次，使细胞溶胀破碎。
4）将标本于2-8 oC 1500×g 离心10 分钟，收集上清备用。
5. 细胞培养上清或其它生物标本：
请 1000×g 离心 20 分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20oC 或-80oC 保存，但应避免反复冻融。
注意：
1. 以上标本均需密封保存，4oC保存应小于1周，-20oC不应超过1个月，-80oC不应超过2个月。
2. 标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。
3. 实验前红细胞裂解液必须用标准品稀释液稀释。
人肿瘤坏死因子α(TNFα)ELISA试剂盒试剂准备
1. 使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温(18-25oC)，试剂不能直接在37oC溶解。
2. 标准品(冻干品)：每瓶标准品加入标准品稀释液1mL，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为1000pg/mL。准备7个稀释标准品的EP管，每个EP管中加入150μL的标准品稀释液，如图依次倍比稀释成不同的梯度，1000pg/mL-500pg/mL-250pg/mL-125pg/mL-62.5pg/mL-31.25pg/mL, 标准品稀释液(0pg/mL)直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
3. 浓洗涤液：用580mL蒸馏水或去离子水将20mL浓洗涤液稀释至600mL，进行30倍稀释。
标本处理
1. 本公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量，预留充足的样本。
2. 实验前应预测标本含量，如果标本浓度过高，应对标本进行稀释，使稀释后的标本符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。
3. 若所检样本不包含在说明书所列样本之中，建议进行预实验验证其有效性，并注意留存样本。
4. 使用化学裂解液制备的组织匀浆或细胞提取液可能会由于某些化学物质的引入导致 ELISA实验结果偏差。
5. 若样本为细胞培养上清，因该类样本干扰因素 较多，如：细胞状态、细胞数量、采样时间等，所以可能存在检测不出的情况。
6. 某些天然蛋白或重组蛋白，包括原核及真核重组蛋白，可能因为与本产品所使用的检测抗体及捕获抗体不匹配，而不被检测出。
7. 建议使用新鲜样本，保存时间过长可能会存在蛋白降解或变性导致实验结果偏差。
人肿瘤坏死因子α(TNFα)ELISA试剂盒操作步骤
1. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
2. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
3. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用
4. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
5. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
6. 温育：操作同3。
7. 洗涤：操作同5。
8. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
9. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
10. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
注意：
1. 试剂准备：准备一次实验所需要的酶标条，其它的可从微孔板上拆下，密封，按照说明书要求保存，以备下次使用。
2. 加样：实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。加样时注意不要有气泡，将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。加样或加试剂时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。因此，一次加样时间(包括标准品及所有样品)最好控制在10分钟内。推荐设置复孔进行实验。
3. 温育：为防止样品蒸发，实验时请将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发，洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态，同时应严格遵守给定的温育时间和温度。
4. 洗涤：充分的洗涤非常重要，在每次洗涤过程中，都要将洗涤液完全甩干。洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数。如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实 验过程中。
5. 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如，每隔10分钟观察一次)，如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
6. 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。
7. 如果实验室内湿度低于60%，推荐使用加湿器提高湿度水平。
实验流程
1. 实验前标准品、试剂及样本的准备；
2. 加样（标准品及样本）50μL，37℃孵育30分钟；
3. 洗板5次，加酶标试剂50ul，37℃孵育半小时；
4. 洗板5次；加入显色液A，B各50ul,37℃孵育显色15分钟
5. 加终止液50μL，立即450nm读数。
6. 计算
人肿瘤坏死因子α(TNFα)ELISA试剂盒计算
各标准品及样本O.D.值扣除空白孔O.D.值后作图(七点图)，如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为纵坐标(或对数坐标)，O.D.值为横坐标(或对数坐标），绘出标准曲线(最佳方程式应依回归方程计算的R2值来定，以R2值越趋近于1为好)。推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert 1.30，根据样品O.D.值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与O.D.值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的O.D.值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
特异性
本试剂盒用于检测人肿瘤坏死因子α(TNFα)，经检测与其它相似物质无明显交叉反应。
由于受到技术及样本来源的限制，不可能完成对所有相关或相似物质交叉反应检测，因此本试剂盒有可能与未经检测的其它物质有交叉反应。
精密度
精密度用样品测定值的变异系数CV表示。CV(%) = SD/mean×100
批内差：取同批次试剂盒对低、中、高值定值样本进行定量检测,每份样本连续测定20 次，分别计算不同浓度样本的平均值及SD值。
批间差：选取3个不同批次的试剂盒分别对低、中、高值定值样本进行定量测定，每个样本使用同一试剂盒重复测定8次，分别计算不同浓度样本的平均值及SD值。
批内差： CV<10%
批间差： CV<12%
人肿瘤坏死因子α(TNFα)ELISA试剂盒稳定性
经测定，试剂盒在有效期内按推荐温度保存，其活性降低率小于5%。
为减小外部因素对试剂盒破坏前后检测值的影响，实验室的环境条件需尽量保持一致，尤其是实验室内温度、湿度及温育条件。其次由同一实验员来进行操作可减少人为误差。
人肿瘤坏死因子α(TNFα)ELISA试剂盒会出现的问题及解决办法：
1. 加入反应终止液后，没有吸光值或吸光值偏低。
a.原因：未加入酶标记物。
解决办法：请按照操作步骤进行。
b.原因：试剂盒内容物未能充分回。
解决办法：确定试剂盒内容物回温后再进行操作。
c.原因：室温太低。
解决办法：若室温太低(<19℃)，请于操作步骤4，适当延长温育时间。
d.原因：未使用试剂盒的清洗液清洗。
解决办法： 请用试剂盒内所提供的清洗液清洗。
e.原因：试剂盒已过有效期限。
解决办法：请更换成仍在有效期限内的试剂盒。
2. 标准曲线线性不佳，或是平行性不好。
a.原因：温育位置避光不好或受到气流干扰。
解决办法： 请确认温育位置既不透光也不透风(如抽屉内)。
b.原因：操作时间拖太久。
解决办法：请在方法熟练后再进行操作。
c.原因：微孔间相互污染。
解决办法： 加样品时，请小心勿溅出微孔外，以免造成其它微孔的污染。
d.原因：标准品或酶标记物所加入的量不一致。
解决办法：请使用已校正过的移液枪，并确保其与吸头之间有高度密合性。
e.原因：添加样品或试剂的操作方法不正确。
解决办法：加样品或试剂时，吸头请勿接触微孔。
f.原因：洗板过程发生问题(如管路堵塞、洗完板后未立刻进行下一步骤)。
解决办法：请随时***洗板机洗板过程，洗完后立即进行下一步骤。
3. 吸光值均偏高(或线性不够陡)。
a.原因：室温太高(>25℃)。
解决办法： 若无法降低室内温度，请适当缩短步骤4的温育时间。
b.原因：底物溶液受到污染。
解决办法： 若发现底物溶液已呈现淡蓝色，请不要再使用。
c.原因：反应时间超过太久。
解决办法：请控制反应时间。
d.原因：酶标记物污染了盒内其它试剂。
解决办法：使用过的吸头应立即丢弃，可避免试剂间相互污染，凡是试剂(特别是酶标记物与底物溶液)接触过的容器应立即清洗干净。(先以漂白水浸泡，再以清水冲洗干净，可确保无残留)
4. 阴性标准品的吸光值低于阳性标准品的吸光值。
a.原因：微孔中的试剂未能充分混合。
解决办法： 试剂加完后，需轻敲盘四周使其充分混合均匀。
b.原因：洗板过程发生问题(同2-f.)。
解决办法：请参考2-f.
c.原因：添加样品或酶标记物的量不一致。
解决办法： 请参考2-d.
注意事项：
A 仔细阅读说明书。
B 检查试剂盒标签上的有效期。如果超过有效期，请勿使用。
C 按说明书确定所有试剂齐全（数量、体积）。
D 标本制备要规范，每份标本体积要按2-3个复孔以上的量制备（贮存），尽量分装做备份。短期内无法实验者，注意低温保存。
E 准备好所有实验额外所需物品，（比如移液器，试管，清洗器，酶标仪）。
F 按说明书将所用试剂平衡至室温，根据检测标本数量确定所需试剂的量。
G 检查试剂盒内每种试剂的贮存条件，保证所有试剂均按照试剂盒内说明书推荐的条件存储。
H 检查不稳定或者变质的试剂溶液（比如沉淀或变色）。有些试剂，比如标准品稀释液或者检测稀释液，可能在设计时就含有沉淀物。所有试剂在滴入酶标板之前，必需充分混匀。而由于沉淀物的特性，在加入酶标板之前，必需不停搅拌。
I 保证充分的孵育时间和温度。
J 切勿使用不同生产批号的试剂取代现有试剂或混合现有试剂。
K 在混合或溶解蛋白溶液时，避免泡沫产生。
L 在实验开始之前，安排好实验流程。
M 在实验开始之前，清洁工作台。
N 若有问题，应与我公司或代理商的技术支持联系