本系列产品目录1. 适用于人或各种动物血液及脏器组织本系列产品检索 2. 相关试剂及耗材 3. 注意事项 4. 应用 5. 产品性能指标 6. 贮藏及保存期限 7. 实验前准备 8. 人或各种动物中性粒细胞分离液使用方法说明及图例 9. 组织单细胞悬液的制备 10. 红细胞裂解液使用说明 11. 人或各种动物中性粒细胞分离液试剂盒使用方法说明及图例 12. 生产企业 13. 参考文献 1. 适用于人或各种动物血液及 各种动物血液及 各种动物血液及脏器组织本系列产品检索：：：：2...相关试剂 2. 相关试剂及耗材A．．．． 试剂 货号 名称 规格 价格 2010C1119 全血及组织稀释液 500ml 400.00 2010X1118 细胞洗涤液 500ml 200.00 Y2013TBD 组织匀浆液 150ml 150.00 NH4CL2009 红细胞裂解液 100ml 150.00 B．．．． 耗材 货号 名称及规格 生产厂商 价格3516 6 孔细胞培养板 50 块/箱 Costar 686.00 3513 12 孔细胞培养板 50 块/箱 Costar 675.00 3524 24 孔细胞培养板 100 块/箱 Costar 1287.003548 48 孔细胞培养板 100 块/箱 Costar 1542.003599 96 孔细胞培养板 100 块/箱 Costar 1367.00430168 25CM 细胞培养瓶(密封盖) 20 个/包 Corning 113.00 430639 25CM 细胞培养瓶(透气盖) 20 个/包 Corning 132.00 430720 75CM 细胞培养瓶(密封盖) 5 个/包 Corning 56.00 430641 75CM 细胞培养瓶(透气盖) 5 个/包 Corning 59.00 430823 150CM 细胞培养瓶(密封盖) 5 个/包 Corning 102.00 430825 150CM 细胞培养瓶(透气盖) 5 个/包 Corning 107.00 431079 175CM 细胞培养瓶(密封盖) 5 个/包 Corning 133.00 431080 175CM 细胞培养瓶(透气盖) 5 个/包 Corning 139.00 431081 225CM 细胞培养瓶(密封盖) 5 个/包 Corning 167.00 431082 225CM 细胞培养瓶(透气盖) 5 个/包 Corning 176.00 430790 15ml 离心管（含泡沫架） 50 支/包 Corning 92.00 430828 50ml 离心管（含泡沫架） 25 支/包 Corning 55.00 430776 250ml 离心管 102 支/箱 Corning 1176.004485 1ml 移液管 50 支/包 Costar 55.00 4486 2ml 移液管 50 支/包 Costar 63.00 4487 5ml 移液管 50 支/包 Costar 92.00 430659 2ml 冻存管（可立外旋） 50 支/包 Corning 117.00 430663 5ml 冻存管（可立外旋） 50 支/包 Corning 131.00 GP2012 玻璃吸管 10 支/包 TBD 30.00 GT201210 10ml 玻璃离心管 10 支/包 TBD 90.00 GT201250 50ml 玻璃离心管 5 支/包 TBD 120.00 L147 100/200 目不锈钢滤网 TBD 150.00 3. .. 注意事项 A． 本分离液是敏光型的，在运输和贮藏过程中应在 18℃-25℃避光保存，启封后置 4℃保存避免微生物污染。另外，本品为真空包装，未启封前置于 10℃ 以下易出现白色结晶，影响分离效果。B． 待分离的血液、组织及细胞要求新鲜，避免冷冻和冷藏。分离液和所分离样本一定在20℃水浴箱中复温20分钟保证分离液和所分离样本温度在20℃±2℃时分离效果最好，且所有操作过程一定要在无菌条件下进行。C． 由于各品牌离心机的性能不同，国内南北地区温度环境和四季的差异，可能影响分离效果，用户可以调节离心转数，调节离心的时间，摸索最佳的分离条件（具体分离条件各实验室自定）。D． 最好使用无静电反应的离心管，推荐使用未经过碱处理的玻璃离心管。E． 最优抗凝剂选择：EDTA、枸橼酸、肝素。应注意在血液稀释过程中应去除抗凝剂体积。F． 分离过程中所用其他试剂如：羟乙一基淀粉 550、全血及组织稀释液、细胞洗涤液及 红细胞裂解液等以我公司产品为最优选择，本公司相关系列产品无菌、无病毒、无支原体、低内毒素水平且无细胞毒性，所获得的细胞可保持完好的生物活性和完整的细胞形态。4. .. 应 用适用于从人或各种动物血液或脏器组织中分离中性粒细胞。5.. . . 产品性能指标pH 7.0-7.5 渗透压 280-340mOsmol/kg 内毒素 ≤0.5...EU/ml无菌 直接接种培养 14 天后培养基澄清 澄明度及不溶性颗粒物 每 50ml 溶液中含 10μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 20 粒以下，，，，含 25μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 5 粒以下6.. . . 贮藏及保存期限18℃-25℃避光保存，有效期两年。启封后置 4℃保存，有效期一周。 注：：：：若保证无微生物污染，启封后可置 4℃长期保存。但应注意保存温度较低时本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。 7. .. 实验前准备 7. 实验前准备A． 试剂中性粒细胞分离液(试剂盒所含试剂)、全血及组织稀释液、细胞洗涤液、红细胞裂解液、组织匀浆液、胎牛血清B． 器材玻璃离心管、玻璃滴管水平转子离心机、无菌工作台8.. . . 各种动物中性粒细胞分离液 各种动物中性粒细胞分离液 各种动物中性粒细胞分离液使用方法说明及图例 使用方法说明及图例A．取 1ml 新鲜抗凝血，与全血及组织稀释液 1:1 混匀后小心加于 1 份本分离液之液面上；或取 1ml 组织单细胞悬液（具体制备方法详见 9.组织单细胞悬液的制备）小心加于 1 份本分离液之液面上； B. 以 500g（约 1800 转/分）离心 25 分钟(半径 15cm 水平转子)。 此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层；为血浆层。第二层；为环状乳白色的单个核细胞层。第三层；；；；为略带混浊的分离液层 为略带混浊的分离液层 为略带混浊的分离液层（富集一定量的中性粒细胞 富集一定量的中性粒细胞 富集一定量的中性粒细胞）。。。。第四层；为红细胞层。弃去第一层血浆层及第二层细胞，收集第三层分离液层和第四层红细胞层 收集第三层分离液层和第四层红细胞层,放入含细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）10ml 的试管中，充分混匀后，以 500g 约（1800 转/分）离心30 分钟。沉淀经 1 次洗涤后用红细胞裂解液（Cat#：NH4CL2009）裂解红细胞，再经 3 次洗涤去除红细胞内溶物和碎片后取沉淀细胞即为所需中性粒细胞。 注：A.提取率约为 80%。 注B. 红细胞裂解过程详见“10.红细胞裂解液使用说明”。 血液（人）中各细胞含量参考值 中各细胞含量参考值 中各细胞含量参考值：：：： 男：4.0-5.5×1012/L(400-550 万个/mm3) 女：3.5-5.0×1012/L(350-500 万个/mm3 红细胞 ) 新生儿：6.0-7.0×1012/L(600-700 万个/mm3) ***：4.0-10.0×109/L(4000-10000 个/mm3) 白细胞 新生儿：15.0-20.0×109/L（15000-20000 个/mm3) 血小板 100-300×109/L（10 万-30 万个/mm3) 名称 占白细胞总数百分比 占白细胞总数百分比 占白细胞总数百分比 嗜中性粒细胞 30%-70% 嗜酸性粒细胞 0.5%-5% 嗜碱性粒细胞 0%-1% 淋巴细胞 20%-40% 白细胞分类计数单核细胞 3%-8% 9.. . . 组织单细胞悬液的制备 组织单细胞悬液的制备注：：：：A.. .. 本说明只提供机械匀浆制备单细胞悬液的方法 本说明只提供机械匀浆制备单细胞悬液的方法 本说明只提供机械匀浆制备单细胞悬液的方法，，，，酶消化法由于各实验 酶消化法由于各实验 酶消化法由于各实验室选取的消化酶种类各不相同，，，，请各实验室自行选择进行试验 请各实验室自行选择进行试验 请各实验室自行选择进行试验。。。。B. .. 全过程及所需试剂要求无菌环境 B. 全过程及所需试剂要求无菌环境 全过程及所需试剂要求无菌环境。。。。 剪碎法：：：：将组织块放入平皿后，加入少量组织匀浆液及 20%胎牛血清；用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入 5ml 组织匀浆液及 20%胎牛血清；用吸管吸取组织匀浆，用 100 目不锈钢滤网(另购)过滤到试管内；离心沉淀 1500转/分×3 min，再用细胞洗涤液清洗 3次，每次以 500rpm短时低速离心除去细胞碎片，以 200 目不锈钢滤网（另购）过滤去细胞团块。作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5）×107个/ml。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用 20%胎牛血清或全血及组织稀释液悬起细胞浓度为 2×108-1×109个/ml 的单细胞悬液备用。 匀浆器法：用眼科剪将组织剪成小块；放入 70ml 组织研磨器内，加入 2ml 组织匀浆液及 20% 匀浆器法胎牛血清；缓慢转动研棒，研磨至匀浆；用 5ml 组织匀浆液及 20%胎牛血清冲洗研器；收集细胞悬液，经 200 目不锈钢滤网（另购）过滤；离心沉淀 800rpm×2min ，再用细胞洗涤液洗 3 次，离心沉淀。作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5）×107 个/ml。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用 20%胎牛血清或全血及组织稀释液悬起细胞浓度为 2×108-1×109个/ml 的单细胞悬液备用。 细胞计数方法: 细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用计数板（血球计数板）进行。既可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。不论计数的对象如何，均须制备分散的细胞悬液。 计数与计算过程 1）、在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片。 2）、用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止。 3）、置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。 4）、按下式计数细胞悬液的密度： 细胞密度＝（4 个大格细胞总数/4）×104个/ml×稀释倍数 公式中乘以 104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1m（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3细胞计数要点： 细胞计数要点：：： A． 进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于 104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；显微镜下计数时，遇到 2 个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如果细胞团>10％，说明细胞分散不充分; 或细胞数<200 个/10mm2或>500 个/10 mm2 时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。 B． 要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。 C． 取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其是多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确； D． 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。 E． 操作时，注意盖玻片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。 初学者易犯的错误： 初学者易犯的错误：：： A． 计数前未将待测悬液吹打均匀。 B． 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。 C． 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。 10.. . . 红细胞裂解液使用说明 红细胞裂解液使用说明本裂解液有别于市场 本裂解液有别于市场上销售的其它红细胞裂解液，，，，其配方经过本公司优化在裂解红细 其配方经过本公司优化在裂解红细胞的同时不损伤并在一定程度上保护淋巴细胞(lymphocyte) 胞的同时不损伤并在一定程度上保护淋巴细胞(lymphocyte) (lymphocyte)或其它有细胞核的细胞 或其它有细胞核的细胞 或其它有细胞核的细胞，，，，所获得的细胞可保持完好的生物活性和完整的细胞形态 得的细胞可保持完好的生物活性和完整的细胞形态。。。。另外，，，，本裂解液中无DNA及RNA酶，，，，配合细胞分离液使用所提细胞可广泛用于细胞培养及分子生物学实验， 合细胞分离液使用所提细胞可广泛用于细胞培养及分子生物学实验，，，请广大用户从优选择 请广大用户从优选择 请广大用户从优选择。。。。 红细胞裂解液(Red Blood Cell Lysis Buffer)，也称ACK Lysis Buffer，是一种用于 从人或鼠等的血液或组织细胞样品中裂解并去除无细胞核红细胞的溶液。 本裂解液不适用于有细胞核红细胞的裂解，例如鸟或禽类的红细胞。本裂解液经过无菌处理，处理过的血液或组织细胞样品可以用于后续的原代培养、细胞融合以及核酸或蛋白的提取及各种常规的分析和检测。使用说明：：：： A. .. 对于组织细胞样品 A. 对于组织细胞样品 对于组织细胞样品：：：： a. 新鲜组织经过胶原酶或胰酶等消化处理，通过适当方法分散成细胞悬液，离心弃上清。 b. 加入3-5倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。例如细胞沉淀的体 积为1ml，则加入3-5ml的红细胞裂解液。本步骤在室温或4度操作均可。 c. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。 d. 如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不 会影响后续的一些检测。 e. 洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心 2-3分钟，弃上清。可再重复1次，共洗涤1-2次。洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀 体积的5倍。4℃离心效果更佳。 f. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。 B. .. 对于组织细胞样品无需洗涤的快速操作步骤 B. 对于组织细胞样品无需洗涤的快速操作步骤 对于组织细胞样品无需洗涤的快速操作步骤：：：： a. 新鲜组织经过胶原酶或胰酶等消化处理，通过适当方法分散成细胞悬液，离心弃上清。 b. 对于0.2ml细胞沉淀加入1ml红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。本步骤在室温 或4度操作均可。 c. 加入15-20ml PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，混匀。 d. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。 e. 如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不 会影响后续的一些检测。 f. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。 注：：：：对于常规步骤，多一步洗涤过程中的离心，但可以节省洗涤液的用量，并且洗涤效果也 更好一些，同时不需要大体积的离心管。快速步骤少了一次离心，但洗涤效果略差一些，同 时需要大体积的离心管。 C. .. 对于血液样品 C. 对于血液样品：：：： a. 取新鲜抗凝血，400-500g离心5分钟，离心弃上清。 b. 加入6-10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。例如细胞沉淀的体 积为1ml，则加入6-10ml的红细胞裂解液。本步骤在室温或4度操作均可。注意：对于鼠 的血液，裂解1-2分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间至4-5分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。 c. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。 d. 如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不 会影响后续的一些检测。 e. 洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心 2-3分钟，弃上清。可再重复1次，共洗涤1-2次。洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀 体积的5倍。4℃离心效果更佳。 f. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。 注：：：：对于微量或少量的血液样品，可以在第一步中不进行离心弃上清的操作，直接在第二步 中加入10倍血液体积的红细胞裂解液，并在室温或4℃裂4-5分钟。对于鼠的血液，裂解4-5 分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间至10分钟，但通常不宜超过15分钟，并且 裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。后续步骤相同。 D. .. 对于血液样品无需洗涤的快速操作步骤 D. 对于血液样品无需洗涤的快速操作步骤 对于血液样品无需洗涤的快速操作步骤：：：： a. 每1ml新鲜抗凝血中加入10ml红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解4-5分钟。本步骤在室 温或4度操作均可。注意：对于鼠的血液，裂解4-5分钟已经足够，对于人的外周血，宜 延长裂解时间至10分钟，但通常不宜超过15分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促 进红细胞裂解。 b. 加入20-30ml PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，混匀。 c. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。 d. 如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不 会影响后续的一些检测。 e. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。 注：：：：对于常规步骤，多一步洗涤过程的离心，但可以节省洗涤液的用量，并且洗涤效果也更 好一些，同时不需要大体积的离心管。快速步骤少了一次离心，但洗涤效果略差一些，同时 需要大体积的离心管。11.. . . 人或各种动物中性粒细胞分离液试剂盒使用方法说明及图例 各种动物中性粒细胞分离液试剂盒使用方法说明及图例Store at：：：RT 试剂盒规格：：：：2×100ml/Kit 试剂盒内容：全血及组织稀释液 100ml细胞洗涤液 100ml试剂 A 2×100ml红细胞裂解液 100ml说明书 1 份操作方法：：：：A．取 1ml 新鲜抗凝血，与全血及组织稀释液 1:1 混匀后小心加于 1 份 A 液之液面上；或取1ml 组织单细胞悬液（具体制备方法详见 9.组织单细胞悬液的制备）小心加于 1 份 A 液之液面上； B. 以 500g（约 1800 转/分）离心 25 分钟(半径 15cm 水平转子)。 此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层；为血浆层。第二层；为环状乳白色的单个核细胞层。第三层；；；；为略带混浊的分离液层 为略带混浊的分离液层 为略带混浊的分离液层（富集一定量的中性粒细胞 富集一定量的中性粒细胞 富集一定量的中性粒细胞）。。。。第四层；为红细胞层。弃去第一层血浆层及第二层细胞，收集第三层分离液层和第四层红细胞层 收集第三层分离液层和第四层红细胞层,放入含细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）10ml 的试管中，充分混匀后，以 500g 约（1800 转/分）离心30 分钟。沉淀经 1 次洗涤后用红细胞裂解液（Cat#：NH4CL2009）裂解红细胞，再经 3 次洗涤去除红细胞内溶物和碎片后取沉淀细胞即为所需中性粒细胞。 注：A.提取率约为 80%。 注B. 红细胞裂解过程详见“10.红细胞裂解液使用说明”。 13. . . . 参考文献［1］ Meier C, Middelanis J, Wasielewski B, et al. 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