细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，自胚胎发育起就参与了众多的生理和病理过程。在正常细胞中，***酯酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）只分布在细胞膜脂质双分子层内侧，即与细胞浆相邻一侧。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把PS外翻到细胞表面，即细胞膜外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜通透性增加等凋亡现象。AnnexinV是一种分子量为35-36KD的Ca²⁺ 依赖性***脂结合蛋白，与PS有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

 Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒是用FITC标记的重组人Annexin V作为探针，来检测细胞早期凋亡的发生，可以使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备进行检测。

本试剂盒还提供了***化丙***(Propidium Iodide, PI)染色液，PI是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期和坏死的细胞由于细胞膜的通透性增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染成红色。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。即PI被排除在活细胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC 和PI 结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。

图1 Annexin V检测细胞凋亡原理

汉恒生物实例分析：

A. 流式细胞仪分析：

FITC最大激发波长为488 nm，最大发射波长525 nm，FITC的绿色荧光在FL1通道检测；PI-DNA复合物的最大激发波长为535 nm，最大发射波长为615 nm，PI的红色荧光在FL2或FL3通道检测。用CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点图（two-color dot plot），FITC为横坐标，PI为纵坐标。每个样采集10，000 events。典型的实验中，细胞可以分成三个亚群，活细胞仅有很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光，晚期凋亡细胞有绿色和红色荧光双重染色（如图2所示）。

B. 荧光显微镜分析：

1） 悬浮细胞：

a. 滴一滴用Annexin V-FITC/PI双染的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。

b. 在荧光显微镜下用双色滤光片观察。Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。

    2）贴壁细胞：

a. 培养皿用平板离心机1000g离心5分钟以使凋亡脱落细胞再次贴壁，吸除细胞培养液，加入PBS洗涤一次。

b. 对于48孔培养皿，加入100μl Annexin V-FITC结合液。

c. 加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。

d. 加入5μl***化丙***染色液，轻轻混匀。

e. 室温(20-25ºC)避光孵育10-20分钟。

f. 加入400μl Annexin V-FITC结合液，轻轻混匀。1小时内进行荧光显微镜观察，Annexin V-FITC为绿色荧光，***化丙***(PI)为红色荧光。

图2. Annexin V-FITC和PI染色后的流式细胞仪检测效果图。正常的活细胞不会被Annexin V-FITC和PI染色(图中左下部分)；凋亡早期的细胞仅被Annexin V-FITC染色，PI染色呈阴性(图中右下部分)；凋亡晚期和坏死的细胞可以同时被Annexin V-FITC和PI染色(图中右上部分)；图中左上部分出现的是许可范围内的检测误差。