Cow  ++ ++++ ++++

Dog  ++++ ++ ++++

Goat  — ++++ ++++

Guineapig IgG1 ++++ ++ ++++

IgG2 ++++ ++ ++++

Hamster + ++ 

Horse TotalIgG ++ ++++ ++++

Koala  — + 

Liama  — + 

Monkey(rhesus)  ++++ ++++ ++++

IgG1 + ++++ ++

IgG2a ++++ ++++ ++++

IgG2b +++ +++ +++

IgG3 ++ +++ +++

Mouse

IgM variable — —

Pig  +++ +++ ++++

Rabbit TotalIgG ++++ +++ ++++

IgG1 — + ++

IgG2a — ++++ ++++

IgG2b — ++ ++

Rat

IgG3 + ++ ++

Sheep TotalIgG +/- ++ ++

++++=结合能力强；++=结合能力中等；—=结合能力弱或没有结合

纯化流程：

本产品分为两种应用：抗体纯化流程和免疫沉淀流程，免疫沉淀流程还分为直接法和间

接法。下面操作就从这三个方面详细介绍。

1、Buffer 的准备

所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm或0.45 μm滤膜过滤。

结合/ 洗涤Buffer: 0.15MNaCl，20 mMNa2HPO4，pH7.0

洗脱Buffer: 0.1M甘氨酸，pH3.0

中和液： 1MTris-HCl，pH8.5

交联Buffer： 0.2M三乙醇胺，pH8.2

终止液： 50 mMTris，pH7.5

2、样品准备

上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH 值，可以用结合/洗涤缓冲液对血清样

品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用结合/洗涤缓冲液透析。

样品在上样前建议离心或用 0.22μm或 0.45μm 滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效

率和防止堵塞柱子。

3、抗体纯化流程操作方法

抗体纯化流程示意图如下：

1)将 rProtein A/G Beads 装入合适的层析柱，层析用 5 倍柱体积的结合Buffer 进行平衡，

使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。

2)将样品加到平衡好的 rProtein A/G Beads 中（保证目的蛋白与 rProtein A Beads 充分接

触，提高目的蛋白的回收率），收集流出液。

3)用10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

4)使用5-10倍柱体积的洗脱Buffer，收集洗脱液，即目的蛋白组分。

5)依次使用3倍柱体积的结合Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5倍柱

体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4 度保存，防止填料被

细菌污染。

6)SDS-PAGE检测将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以

及原始样品使用SDS-PAGE 检测纯化效果。

4、 免疫沉淀直接法操作流程

免疫沉淀直接法操作流程示意图如下：

4.1 抗体吸附

1）取适量的 rProtein A/G Beads 加入到2ml离心管中，500转离心1min，吸弃上清。

2)加入0.5ml结合Buffer，悬浮填料（使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护

蛋白的作用），500 转离心1min，吸弃上清。再重复两次。

3)向步骤2)平衡的填料中加入抗体溶液，悬浮填料，室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻

翻转离心管，约30min 后，500 转离心1min，收集上清液，留待检测。

4)向3)的填料中加入0.5ml的洗杂Buffer，悬浮填料，进行清洗，去除非特异性吸附的杂

蛋白，500 转离心1min，吸弃上清。再重复两次。

4.2 抗体交联 (备选)

如果需要将抗体和目标抗原复合物共同洗脱，请忽略本步骤，直接进行4.3。

1) 向清洗过的填料中加入1ml 交联Buffer，500 转离心1min，吸弃上清。

2) 再向其中加入1ml20 mMDMP（dimetylpimelimidatedihydrochloride）的交联Buffer，

此试剂需要现用现配，悬浮填料，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，促使

Buffer 和填料充分接触，约30min 后，500 转离心1min，吸弃上清。

3) 再向其中加入1ml 终止液，悬浮填料，终止交联反应，在室温下置于翻转混合仪或者手

工轻轻翻转离心管，约15min 后，500 转离心1min，再吸弃上清。

4)加入0.5ml的洗杂Buffer，悬浮填料，进行清洗，500转离心1min，吸弃上清。再重复两

次。

4.3 抗原沉淀反应

1)抗原吸附：加入含有抗原的样品，用移液器轻轻吹打使抗原与填料-抗体复合物均匀分散。

在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管10min，使抗原与抗体充分结合，如结合

力较弱则可在室温下反应1h 或者在4℃下反应过夜。

2)洗杂：将上述完成抗原吸附的填料-抗体-抗原复合物进行离心，500 转离心 1min，收集

上清液，置于冰上以备后续检测。向离心管中加入 1ml洗杂 Buffer，用移液器轻轻吹打使

填料-抗体-抗原复合物均匀分散，然后进行离心分离，500 转离心1min，弃上清液。再重复

洗涤两次。最后加入 1ml洗杂液，用移液器将填料-抗体-抗原复合物悬液转移至新的

1.5 ml离心管中，并进行离心分离，500转离心1min，弃上清液。

3)抗原洗脱：提供以下两种抗原洗脱方案，可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方

法。

变性洗脱法： 此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE 检测。向离心管中加入

25μl1×SDS-PAGELoadingBuffer混合均匀，95℃加热5min。然后进行离心，500转离心

1min，收集上清液，进行SDS-PAGE 检测。

非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向离心

管中加入5 倍柱体积的洗脱Buffer，用移液器吹打5 次，混匀，然后在室温下置于翻转混

合仪或者手工轻轻翻转离心管，10min 后，离心，500 转离心1min，吸取上清液，收集洗脱

组分，即为目标抗原，收集上清液至新的离心管中，并立即加入十分之一体积的中和液，将

洗脱组分pH 调节至7.0-8.0，用于后期功能分析。

5 免疫沉淀间接法操作流程

免疫沉淀间接法操作流程示意图如下：

1)抗体与抗原混合：将抗体与含有目的蛋白的裂解液混合，室温震荡孵育30min-60min，或

者2-8 度孵育过夜，取决于抗体与抗原的结合效率以及抗原的稳定性，需要自己优化结合条

件。形成抗原-抗体混合物。

注意：抗体的加入量要考虑到下面填料的量，抗体的加入量过多会影响到抗原-抗体混

合物与填料的结合。建议抗体加入量为填料80%的最大载量。

2)填料准备：取适量的 rProtein A/G Beads 加入到2ml离心管中，500 转离心 1min，吸弃

上清。加入0.5ml 结合Buffer，悬浮填料（使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到

保护蛋白的作用），500 转离心1min，吸弃上清。再重复两次。

3)抗原-抗体混合物的吸附：将步骤2.5.1中得到的抗原-抗体混合物加入到处理好的填料中，

均匀，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，促使样品和填料充分接触并吸

附，约30min 后，约30min 后，500 转离心1min，收集上清液，留待检测。

4)洗杂：向上述离心管中加入0.5ml的洗杂Buffer，悬浮填料，进行清洗，去除非特异性吸

附的杂蛋白，500 转离心1min，吸弃上清。再重复两次。

5)抗原洗脱：提供以下两种抗原洗脱方案，可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方

法。

变性洗脱法： 此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE 检测。向离心管中加入

25μl1×SDS-PAGELoadingBuffer混合均匀，95℃加热5min。然后进行离心，200转离心

1min，收集上清液，进行SDS-PAGE 检测。

非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向离心

管中加入5 倍柱体积的洗脱Buffer，用移液器吹打5 次，混匀，然后在室温下置于翻转混

合仪或者手工轻轻翻转离心管，10min 后，离心，500 转离心1min，吸取上清液，收集洗脱

组分，即为目标抗原，收集上清液至新的离心管中，并立即加入十分之一体积的中和液，将

洗脱组分pH 调节至7.0-8.0，用于后期功能分析。

填料清洗

rProtein A/G Beads 可以重复使用而无需再生，但随着一些变性物质的沉淀和蛋白的聚

集，往往造成流速和结合载量都下降，严重影响柱子的性能，这时需要对树脂进行清洗。

去除一些沉淀或变性物质 用2 倍柱体积的6M 盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用5 倍柱体

积的PBS,pH7.4清洗。去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质 用3-4倍柱体积的

70%乙醇或 2 倍柱体积的 1% Triton™X-100 清洗，然后然后立即用 5 倍柱体积的

PBS,pH7.4清洗。

问题及解决⽅案

原因分析 推荐解决方案

柱子反压过高 筛板被堵塞 清洗或更换筛板

填料被堵塞 按照第3 部分进行树脂清洗

裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上柱

前使用滤膜(0.22 or0.45 μm)过滤，或

者离心去除。

样品纯化过程中 去除样品或柱子中的气泡

曲线不稳

样品或buffer 中有气

泡

样品和buffer 进行脱气

洗脱组分中没有目的蛋 样品中抗体浓度太低 使用其抗原做配体的介质

白

抗体被降解 适当的提高洗脱pH

回收率逐渐减低 上样量太多 减少上样量

柱子太脏，载量降低 按照第3 部分进行树脂清洗

 

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