北京索莱宝科技有限公司 张净花 010-56371206

产品介绍

rProtein A/G Beads 是将rProteinA/G 高密度定向偶联到琼脂糖凝胶微球表面，该产品具有更高的抗体结合能力和较低的蛋白非特异吸附率，洗脱条件更均一，一步纯化即可从血清样品中分离出纯度大于90%的抗体。

一、产品基本信息

产品名称：rProtein A/G Beads

产品编码：R8280

英文名称：rProtein A/G Beads

别名：rProtein A/G、琼脂糖凝胶亲和层析介质

储存条件：2-8℃

供应商：solarbio

联系方式：010-56371206 13426459985 

二、rProtein A/G Beads 产品性能：

指标                                        性能

基质                                4%琼脂糖微球

配体                               重组蛋白A/G

载量                             >30mg人lgG/ml介质

粒径(μm)                       45-165

最大流速                          0.1 MPa,1 bar

pH稳定范围                   3-10

储存缓冲液                 20% 乙醇

储存温度                     2°C-8°C

三、ProteinA 和ProteinG 对不同抗体的结合能力：

(++++=结合能力强；++=结合能力中等；—=结合能力弱或没有结合)

种属                          亚型                     Protein A                     Protein G                  Protein A/G

 Human                    IgA                         varible                               —                             ++

 Human                    IgD                           —                                    —                              —

 Human                     IgE                          —                                     —                              —

 Human                    IgG1                     ++++                                ++++                         ++++

 Human                    IgG2                     ++++                                ++++                         ++++

 Human                   IgG3                       —                                   ++++                           ++++

 Human                    IgG4                     ++++                                ++++                          ++++

 Human                     IgM                       varible                              —                               ++

Avianeggyolk           IgY                         —                                      —                                — 

Cow                                                         ++                                  ++++                          ++++ 

Dog                                                        ++++                               ++                               ++++

Goat                                                        —                                   ++++                           ++++

Guinea pig               IgG1                   ++++                                  ++                              ++++

Guinea pig           IgG2                      ++++                                  ++                               ++++

Hamster                                                 +                                       ++ 

Horse                      Total IgG              ++                                   ++++                          ++++

Koala                                                     —                                   + 

Liama                                                    —                                     + 

Monkey(rhesus)                                ++++                               ++++                            ++++

Mouse                   IgG1                        +                                     ++++                             ++

Mouse                    IgG2a                  ++++                                 ++++                           ++++

Mouse                    IgG2b                   +++                                    +++                             +++

Mouse                   IgG3                       ++                                      +++                           +++

Mouse                   IgM                    variable                             —                                   —

Pig                                                       +++                                     +++                        ++++

Rabbit                  TotalIgG               ++++                                  +++                              ++++

Rat                        IgG1                       —                                        +                                 ++

Rat                       IgG2a                     —                                     ++++                               ++++

Rat                       IgG2b                    —                                       ++                                 ++

Rat                       IgG3                       +                                       ++                                    ++

Sheep                 TotalIgG                 +/-                                    ++                                   ++

 

纯化流程：

    本产品分为两种应用：抗体纯化流程和免疫沉淀流程，免疫沉淀流程还分为直接法和间接法。下面操作就从这三个方面详细介绍。

1、Buffer 的准备

所用水和Buffer 在使用之前建议用0.22μm或0.45 μm 滤膜过滤。

结合/ 洗杂Buffer： 0.15MNaCl，20 mMNa2HPO4，pH7.0

洗脱Buffer： 0.1M 甘氨酸，pH3.0

中和液： 1MTris-HCl，pH8.5

交联Buffer： 0.2M三乙醇胺，pH8.2

终止液： 50 mMTris，pH7.5

2、样品准备

上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH 值，可以用结合/洗杂缓冲液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用结合/洗杂缓冲液透析。

样品在上样前建议离心或用0.22μm或0.45μm 滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

3、抗体纯化流程操作方法

抗体纯化流程示意图如下：

1)将 rProtein A/G Beads 装入合适的层析柱，层析用5 倍柱体积的结合Buffer 进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。

2)将样品加到平衡好的 rProtein A/G Beads 中（保证目的蛋白与rProtein A Beads 充分接触，提高目的蛋白的回收率），收集流出液。

3)用10-15 倍柱体积的洗杂Buffer 进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

4)使用5-10 倍柱体积的洗脱Buffer，收集洗脱液，即目的蛋白组分。

5)依次使用3 倍柱体积的结合Buffer 和5 倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5 倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4 度保存，防止填料被细菌污染。

6)SDS-PAGE 检测将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用SDS-PAGE 检测纯化效果。

4、 免疫沉淀直接法操作流程

免疫沉淀直接法操作流程示意图如下：

         

4.1 抗体吸附

1）取适量的 rProtein A/G Beads 加入到2ml离心管中，500 转离心1min，吸弃上清。

2)加入0.5ml 结合Buffer，悬浮填料（使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用），500 转离心1min，吸弃上清。再重复两次。

3)向步骤2)平衡的填料中加入抗体溶液，悬浮填料，室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，约30min 后，500 转离心1min，收集上清液，留待检测。

4)向3)的填料中加入0.5ml 的洗杂Buffer，悬浮填料，进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，500 转离心1min，吸弃上清。再重复两次。

4.2 抗体交联 (备选)

如果需要将抗体和目标抗原复合物共同洗脱，请忽略本步骤，直接进行4.3。

1) 向清洗过的填料中加入1ml 交联Buffer，500 转离心1min，吸弃上清。

2) 再向其中加入1ml20 mMDMP（dimetylpimelimidatedihydrochloride）的交联Buffer，此试剂需要现用现配，悬浮填料，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，促使Buffer 和填料充分接触，约30min 后，500 转离心1min，吸弃上清。

3) 再向其中加入1ml 终止液，悬浮填料，终止交联反应，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，约15min 后，500 转离心1min，再吸弃上清。

4)加入0.5ml 的洗杂Buffer，悬浮填料，进行清洗，500 转离心1min，吸弃上清。再重复两次。

4.3 抗原沉淀反应

1)抗原吸附：加入含有抗原的样品，用移液器轻轻吹打使抗原与填料-抗体复合物均匀分散。在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管10min，使抗原与抗体充分结合，如结合力较弱则可在室温下反应1h 或者在4℃下反应过夜。

2)洗杂：将上述完成抗原吸附的填料-抗体-抗原复合物进行离心，500 转离心1min，收集上清液，置于冰上以备后续检测。向离心管中加入1ml洗杂Buffer，用移液器轻轻吹打使填料-抗体-抗原复合物均匀分散，然后进行离心分离，500 转离心1min，弃上清液。再重复洗涤两次。最后加入1ml洗杂液，用移液器将填料-抗体-抗原复合物悬液转移至新的1.5 ml离心管中，并进行离心分离，500 转离心1min，弃上清液。

3)抗原洗脱：提供以下两种抗原洗脱方案，可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。

     变性洗脱法： 此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE 检测。向离心管中加入25μl1×SDS-PAGELoadingBuffer混合均匀，95℃加热5min。然后进行离心，500 转离心1min，收集上清液，进行SDS-PAGE 检测。

    非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向离心管中加入5 倍柱体积的洗脱Buffer，用移液器吹打5 次，混匀，然后在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，10min 后，离心，500 转离心1min，吸取上清液，收集洗脱组分，即为目标抗原，收集上清液至新的离心管中，并立即加入十分之一体积的中和液，将洗脱组分pH 调节至7.0-8.0，用于后期功能分析。

5 免疫沉淀间接法操作流程

免疫沉淀间接法操作流程示意图如下：

1)抗体与抗原混合：将抗体与含有目的蛋白的裂解液混合，室温震荡孵育30min-60min，或者2-8 度孵育过夜，取决于抗体与抗原的结合效率以及抗原的稳定性，需要自己优化结合条件。形成抗原-抗体混合物。

    注意：抗体的加入量要考虑到下面填料的量，抗体的加入量过多会影响到抗原-抗体混合物与填料的结合。建议抗体加入量为填料80%的最大载量。

2)填料准备：取适量的 rProtein A/G Beads 加入到2ml离心管中，500 转离心1min，吸弃上清。加入0.5ml 结合Buffer，悬浮填料（使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用），500 转离心1min，吸弃上清。再重复两次。

3)抗原-抗体混合物的吸附：将步骤2.5.1 中得到的抗原-抗体混合物加入到处理好的填料中，均匀，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，促使样品和填料充分接触并吸附，约30min 后，约30min 后，500 转离心1min，收集上清液，留待检测。

4)洗杂：向上述离心管中加入0.5ml 的洗杂Buffer，悬浮填料，进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，500 转离心1min，吸弃上清。再重复两次。

5)抗原洗脱：提供以下两种抗原洗脱方案，可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。

    变性洗脱法： 此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE 检测。向离心管中加入25μl1×SDS-PAGELoadingBuffer混合均匀，95℃加热5min。然后进行离心，200 转离心1min，收集上清液，进行SDS-PAGE 检测。

    非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向离心管中加入5 倍柱体积的洗脱Buffer，用移液器吹打5 次，混匀，然后在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，10min 后，离心，500 转离心1min，吸取上清液，收集洗脱组分，即为目标抗原，收集上清液至新的离心管中，并立即加入十分之一体积的中和液，将洗脱组分pH 调节至7.0-8.0，用于后期功能分析。

填料清洗

rProtein A/G Beads 可以重复使用而无需再生，但随着一些变性物质的沉淀和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量都下降，严重影响柱子的性能，这时需要对树脂进行清洗。去除一些沉淀或变性物质 用2 倍柱体积的6M 盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用5 倍柱体积的PBS,pH7.4 清洗。去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质 用3-4 倍柱体积的70%乙醇或2 倍柱体积的1% TritonX-100 清洗，然后然后立即用5 倍柱体积的PBS,pH7.4清洗。

问题及解决方案

 

	原因分析	 推荐解决方案
柱子反压过高	筛板被堵塞	清洗或更换筛板
	填料被堵塞	按照填料清洗部分进行树脂清 洗裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜(0.22 or0.45 μm)过滤，或者离心去除。
样品纯化过程中曲线不稳	样品或buffer 中有气泡	去除样品或柱子中的气泡
样品纯化过程中  曲线不稳	样品或buffer 中有气 泡	去除样品或柱子中的气泡
		样品和buffer 进行脱气
洗脱组分中没有目的蛋白	样品中抗体浓度太低	使用其抗原做配体的介质
	抗体被降解	适当的提高洗脱pH
回收率逐渐减低	上样量太多	减少上样量
	柱子太脏，载量降低	按照填料清洗部分进行树脂清洗