Q-Sepharose HP Q-琼脂糖凝胶 HP
型号:null    产品货号： S9200-100
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品牌: 中国/北京

⑹视梅段П疽徊酱痈髦盅分写炕堪彼岬鞍酌咐辔镏省Ｋ摹⒂τ檬道笛槊疲�***甲脒琼脂糖凝胶 FF分离尿激酶。实验步骤：（1）***甲脒琼脂糖凝胶 FF装柱，1.6×20m，柱床体积为10ml（2）用缓冲液1平衡2-5个床体积，流速为2ml/min（3）取尿激酶粗品200mg溶解在20ml的缓冲液1中，用0.45μm的滤膜过滤，上样，流速为1ml/min（4）用缓冲液1再洗2-5个床体积，流速为2ml/min（5）最后缓冲液2进行洗脱，流速为2ml/min，收集洗脱峰，用SDS-PAGE纯化后的效果。（6）用纯水洗5个柱床体积，然后分别用100mM，pH8.0Tris-HCl缓冲液含1M NaCl和100mM,pH4.0的醋酸缓冲液含1M NaCl交替洗涤3次，再用纯水洗3个柱床体积，然后再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于+4~8℃环境中保存。（7）色谱图见图1，SDS-PAGE结果见图2。 缓冲液组成：缓冲液1：100mM pH7.4的PBS缓冲液；缓冲液2：100mM醋酸缓冲液，pH4.0。也可以用这个填料特异去除各种融合蛋白酶切后的丝氨酸蛋白酶，例如凝血酶以及胰蛋白酶类蛋白酶。例如去除凝血酶上样缓冲液为：50mM pH7.4的PBS缓冲液含0.15M NaCl,洗脱缓冲液为：50mM pH7.4的PBS缓冲液含1M NaCl。SDS-PAGE流程：（1）BSA法测量样品蛋白浓度；（2）根据测定样品的蛋白浓度，算出5-10μg/孔所需的体积；（3）向1.5ml EP管中加入含5-10μg蛋白的样品溶液，若体积小于10μL，则加20mM PBS pH7.4补足10μl；若体积大于10μl，则要加入1ml无水乙醇，－20℃下浓缩1h；（4）取浓缩样品10000rpm离心15min，除去上清，37℃烘箱10min去除残余的乙醇；（5）在样品加入20mM PBS pH7.4和2×loading buffer各10μl，100℃下10min。取出后用冷却30s，4000rpm离心1s；（6）点样，电泳。五、注意事项：5.1 色谱柱装填1、所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。2、在柱子下端加入蒸馏水，以除去柱子中的空气，关闭柱子出口，在柱内保留少量的蒸馏水。3、将琼脂糖凝胶连续倒入柱子时，要用玻璃棒的紧靠柱子内壁引流，以减少气泡的产生，让填料先自然沉降。4、柱压不超过0.3MPa，如果装柱系统中无法测柱压，则控制流速高于300cm/h，但是在使用中一般只用最大流速的75%。5.2 蛋白的结合平衡缓冲液可以采用如下配方：100mM pH7.4的PBS缓冲液，0.1M NaCl，pH8.0。上样完毕后，继续用平衡缓冲液洗柱子，直到基线平稳。5.3 蛋白的洗脱（1）洗脱可以采取特异性或者非特异性洗脱。（2）特异性洗脱可以用目标分子的竞争剂，对氨基***甲脒的抑制剂。对非特异性洗脱而言，可以选用以下几种方法：a 改变离子强度，通常加入1M的NaCl，必要的话可以采用阶段洗脱或线性梯度洗脱。b 改变pH，可采用阶段洗脱洗脱或线性梯度洗脱来达到目的。c 降低洗脱缓冲液的极性。如可以在洗脱缓冲液中加入10%的二氧六环等。d 使用变性剂。如在洗脱缓冲液中加入尿素、盐酸胍等。六、再生、清洗6.1 再生用纯水洗5个柱床体积，然后分别用100mM，pH8.0Tris-HCl缓冲液含1M NaCl和100mM,pH4.0的醋酸缓冲液含1M NaCl交替洗涤3次，再用水洗3个柱床体积，然后再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于+4~8℃环境中。如果在色谱操作过程中用到了变性剂或者去污剂，也可以用上述方法洗柱子。6.2 清洗在应用中，柱子上结合的一些物质如变性蛋白和脂质等不能通过再生过程去除，这种情况下，可以用去污剂如0.1%Triton X-100在37℃洗柱子1min。之后立即用5个床体积的平衡液洗柱子。七、保存在20%乙醇中，4℃下长期保存。Solarbio Beijing Solarbio Science & Technology Co., LtdTel: 010-56371210Fax: 010-56371281/82Http://www.solarbio.cn