hTNF14 慢病毒颗粒
型号:null
价格:请致电:010-57128832,18610462672
品牌: 国外


本产品通过引物设计导入突变,并采用高保真的HiFi-Pfu酶,由PCR分别生成多个突变DN**段,然后通过同源重组将这些突变DN**段相互连接,并与载体进行融合,经转化后产生突变后的基因。


 

 



产品优势:

1.灵活性大
打破了突变只能在质粒上进行的束缚。突变所需的PCR模板不但可以来自质粒,也可来自以其他形式存在的DNA。而且不同来源的多个突变DN**段通过同源重组可一次性组装成所需的突变基因。重组过程不需T4 多聚***酸激酶和连接酶。
2.突变域大
可以实现几个碱基的替换、插入或缺失,还能进行几十个碱基的插入或缺失。
3.突变的真实性
由于采用高保真HiFi-Pfu聚合酶,可以得到高达95%的突变体,不会引入多余突变。而且通过优化条件将PCR循环数降至最低,PCR过程中的次生位点突变(目标突变以外的突变)的可能性极小。
4.操作简单
不需使用***酸化引物、不需Dpn I内切酶对甲基化的质粒DNA模板降解。



 


操作过程:

 

 


(一)载体线性化
采用酶切或PCR扩增方法可以将载体线性化。建议利用双酶切,因为质粒的线性化不彻底将会导致大量阴性克隆的产生。如使用PCR扩增获得线性化质粒,所用的酶应选用高保真酶(如Pfu聚合酶)。

(二)引物的设计
首先,设计引物时应该在遵循常规引物设计原则的基础上,把突变设计入引物。其次,引物的纯度对突变成功率有很大影响,因此使用HPLC或PAGE纯化的引物。

 

 

 

1.载体两端的引物设计

引物末端应与载体末端至少具有10-15个同源碱基,由此得到的PCR产物两端便分别带上了10-15个与载体序列同源性的碱基。

 

 



2.突变引物的设计

 

 



 



3.
PCR扩增

(1)使用设计好的引物分别进行多个突变DN**断的PCR扩增:


 



(2)按以下2步法扩增条件进行PCR:



(3)如果按上述条件操作结果不理想,可尝试按以下3步法扩增条件进行PCR:

 

 


4.突变片断的组装

(1)将多个突变PCR片段和线性化载体以摩尔比1:1加到试管中进行组装反应,较长的PCR片段要增加其添加量,以维持其适当摩尔数目:

 

 

 

 

(2)混匀后在42℃孵育30分种,然后转移到冰上。
(3)使用5 μl反应液转化到感应态细菌中。