无内毒素质粒大量提取试剂盒

保存：常温干燥保存，复检期为一年。

试剂盒组成	D1150-10T
RNaseA	1ml
内毒素清除剂	100ml
溶液P1	40ml
溶液P2	40ml
溶液P3	40ml
结合液	120ml
漂洗液	15×2ml
洗脱液	30ml
吸附柱	10个
收集管	10个
说明书	1份

产品说明： 

  本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的 DNA 的原理特异性提取质粒 DNA。  离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附 DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。 Solarbio 公司研制的内毒素清除剂，可最大限度地除去内毒素。从 50-100ml 大肠杆菌LB 培养液中，可快速提取 200-300μg 高纯度高拷贝的质粒 DNA，提取率达 85-90%。使用本试剂盒提取的质粒DNA纯度高，可直接用于细胞转染等要求较高的实验，以及其他各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。溶液 P1在使用前先加入 RNaseA（将试剂盒中提供的 RNaseA 全部加入） ，混匀，置于 2-8℃保存。如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。  

操作步骤: 

1、取 50-100ml 细菌培养物，11000rpm 离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。 

2、向留有菌体沉淀的离心管中加入 4ml 溶液P1(请先检查是否已加入 RNaseA） ，使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。 

3、向离心管中加入 4ml 溶液 P2，温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解。注意：混匀一定要温和，以免污染细菌基因组 DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过 5 min，以免质粒受到破坏。 

4、向离心管中加入 4ml溶液 P3，立即温和地上下翻转 6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。11000rpm离心 10 min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。注意：溶液 P3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。 

5、加入上清1/5 体积的冰上预冷的内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴 2min 至溶液变清亮。 

6、37℃水浴5min,不时振荡，溶液又变浑浊。11000rpm 室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒 DNA，下层油相含内毒素。 

7、将含质粒 DNA 的上层水相转移至新管，弃下层油相，注意不要吸入油状相。重复抽提三次，即重复步骤 5-7三次。 

8、加入 12ml 的结合液，充分混匀后加入吸附柱中，室温放置 2min，11000rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。如果溶液量多可分多次加入。 

9、向吸附柱中加入 8ml漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，11000rpm 离心 1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 

10、向吸附柱中加入 6ml 漂洗液，11000rpm 离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 

11、11000rpm 离心 3min，将吸附柱敞口置于室温或 50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去

除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR 等。 

12、 将吸附柱放入一个干净的离心管中， 向吸附膜中央悬空滴加1-2ml经65℃水浴预热的洗脱液， 室温放置5min，11000rpm 离心2min。 

13、为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置 5min，11000rpm 离心 2min。 

注意事项: 

1.  使用前请先检查溶液 P2、P3 和结合液是否出现混浊，如有混浊现象，可在 37℃水浴中加热几分钟，待溶液恢复澄清后再使用。 

2.  洗脱缓冲液体积不应少于 1ml，体积过小影响回收效率;洗脱液的 pH值对洗脱效率也有影晌，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，  pH值低于7. 0会降低洗脱效率，  DNA产物应保存在-20℃，以防 DNA降解。 

3.  质粒DNA浓度＞1mg/ml时清除内毒素效率降低。由于质粒DNA本身的性质，清除过程可导致部分质粒DNA丢失，但内毒素却能得到最大限度清除。 

4.  所有溶液应用无内毒素的高纯水配制，所有器械材料均应不含内毒素，玻璃器皿可高温烘烤，非挥发性水溶液可高压处理。 

5. DNA浓度及纯度检测：得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。  得到的DNA可用琼脂糖疑胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。 DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为 1 相当于大约 50μg/ml双链DNA、 40μg/ml单链DNA。OD260/OD280比值应为 1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响吸光值，但并不表示纯度低。  

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