RISO是一种快捷方便的RNA提取试剂，可从细胞、组织等材料中提取RNA。在样品处理过程中，RISO可完全充分裂解样品，同时保持RNA的完整性。加入氯仿离心后，溶液形成上清层水相、中间层和下层有机相。取上清层，籍异丙醇沉淀回收RNA；中间层用乙醇沉淀可同时回收DNA；有机相可用异丙醇沉淀回收蛋白。

RISO试剂可用于少量样品 (如活检标本) RNA提取，也可用于大量样品 (如大组织器官) RNA提取。提取RNA整个过程方便快速，整个操作过程可一个小时内完成，提取的RNA无蛋白和DNA的污染，纯度髙，可直接用于Northern Blotting (RNA印迹分析)、斑点杂交、进一步Poly(A)⁺ (mRNA) 纯化、体外翻译、RNase保护分析、RT-PCR、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。

 

主要特点：
1.   抗降解作用强：RNA酶 (RNase) 在RISO中快速失活，确保RNA抽提高质、高量，重复性好。
2.   细胞、组织均适用：适用于各种细胞和标本，对少量组织标本 (如活检标本) 尤其适用。
3.   操作简捷、省时，即使对初次操作者亦适用。
实验准备

RNA酶 (RNase) 是导致RNA降解最主要因素，其自身非常稳定，仅在一些极端的条件下可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规的高温高压蒸汽灭菌法、蛋白酶抑制剂时常不能有效抑制RNase活性。RNase广泛存在于人的皮肤表面，对操作有严格要求。

1.         制备RNA过程中必须戴手套、口罩，使用专用超净工作台。

2.         移液器一般情况下采用以DEPC-H₂O配制的70乙醇擦洗移液器的内部和外部，可基本达到要求。

3.         使用无RNase的实验器材：枪头、塑料制品和玻璃制品可以用0.1 DEPC (焦碳酸二乙酯) 水溶液处理过夜，然后在121 °C下高压湿热灭菌30 min以去除残留的DEPC，烘干备用。玻璃制品及金属器械可用干热灭菌去除RNase (160-170 °C烘烤2hrs以上)。

4.         配制溶液应使用DEPC-H₂O (DEPC-H₂O的配制方法：ddH₂O加入DEPC至终浓度0.1 (V/V)，放置过夜，然后在120 °C下高压湿热灭菌30 min，冷却后备用)。

5.         整个实验过程中使用的试剂，实验器材和DEPC-H₂O应专用，避免交叉污染。

 

表1.各种样品的最大使用量 (1 mL RISO)：

 

 

 

 

表2.大量组织RNA抽提使用量：

 

*当组织重量达到5 g时，按每克组织加入2 mL RISO计算。

一、   操作步骤

用户自备试剂：DEPC-H₂O、氯仿、异丙醇、70乙醇（DEPC-H₂O配制）。

注意：①如果组织量（1-10 mg）或细胞数很少（10²-10⁴），在样品中加入800 μL的RISO，用枪头反复抽吸混匀，可再加入糖原 (终浓度为250 μg/ml)，以提高RNA的产率，糖原 (低于4 mg/ml) 的存在，不影响cDNA第一链的合成,也不影响PCR。剧烈振荡或用匀浆器匀浆。②组织块用液氮研磨，效果最好，若没有液氮或电动匀浆器，可用手动匀浆器代替，此时组织块不宜过大，且需先用眼科剪刀将组织剪碎，然后再充分匀浆。

1.         样品处理：

(1) 贴壁培养细胞：

① 倒净培养液；② 每10 cm²生长的培养细胞中加入1 mL RISO试剂，在室温下水平放置5 min，使裂解液均匀分布于细胞表面，然后吹打细胞使细胞脱落；③ 将细胞裂解液转移至离心管中，并用1 mL枪头反复吹打直至裂解液中无明显沉淀，在室温下放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。

(2) 悬浮培养细胞：

① 直接离心收集细胞，倒净培养液；② 细胞沉淀中每5-10× 10⁶细胞加入1 mL RISO试剂；③ 将细胞裂解液转移至离心管中，用1 mL枪头反复吹打直至裂解液中无明显沉淀，室温下放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。

(3) 动、植物及其它组织材料：

① 将组织在液氮中或与干冰共同磨碎成粉末状 (应无明显颗粒)；② 每50-100 mg的组织加1 mL RISO试剂 (大于200 mg的组织按表2加入相应体积的RISO)，样品的体积不应超过RISO试剂体积的10，用匀浆器进行匀浆，至匀浆液呈无颗粒状；③ 将裂解液转移至离心管中，在室温下放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离；④ 12,000 g，4 °C离心10 min，然后小心吸取上清液，移入新的离心管中。

2.         向上述步骤1得到的匀浆液中加入0.2 mL氯仿 (每使用1 mL RISO加0.2 mL氯仿)，盖紧管盖，用手上下振荡15 sec，得浑浊液，无分层现象，室温静置2-3 min。

3.         12,000 g，4 °C离心15 min。离心后，样品分为三层：无色上清水相、中间蛋白层及下层有机相，水相的体积约为所用RISO试剂的60。

4.         小心吸取无色上清液至另一离心管 (若需分离DNA和蛋白，则小心保留中间层和有机相)。

5.         加入0.5 mL异丙醇 (每使用1 mL RISO加0.5 mL异丙醇)，轻轻混匀，室温静置10 min。

6.         12,000 g，4 °C离心10 min。

7.         弃去上清，加1 mL 70乙醇 (每使用1 mL RISO试剂至少加1 mL 70乙醇)，涡旋振荡混匀。

8.         7,500 g，4 °C离心5 min。

9.         弃尽上清，超净工作台干燥沉淀或真空离心干燥 (不可太干，否则RNA将会难以溶解)，加入适量DEPC-H₂O溶解RNA沉淀 (可在55-60 °C促溶10 min)。

10.     RNA的分析和定量：

(1)    用分光光度计测定样品在260 nm和280 nm的吸收值确定RNA的质量。OD260/280在1.8-2.1视为抽提的RNA的纯度很高。

(2)   

A      B

进行甲醛变性琼脂糖电泳，确定RNA的完整性和污染情况。

28S

18S

5S

RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。在非变性电泳中，可以分离混合物中不同分子量的RNA分子，但是无法确定分子量。只有在变性情况下，RNA分子完全伸展，其泳动率与分子量成正比。

A：标本1     B：标本2

判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。在有EB存在时，完整未降解的RNA制品电泳图谱应可清晰看到18S rRNA、28S rRNA两条带，也应当能看到一条由tRNA、5.8S rRNA和5S rRNA组成的、较模糊迁移较快的条带，且28S rRNA条带亮度应为18S rRNA的1.5-2倍。

二、   注意事项

本试剂含强变性剂，应避免与皮肤接触，如接触皮肤，应立即用大量的水冲洗，严重者到医院处理。本品含有酚类，具有特殊气味，请于取用试剂溶液后马上盖好瓶盖，或于通风橱中操作。

三、  常见问题分析

 

1.       通常情况下每毫克组织或1×10⁶个细胞预期提取RNA量：

2.       常见问题及解决方案：