黄曲霉毒素

黄曲霉毒素是有毒的代谢物，是由曲霉菌演生出的。它是一种至癌物，可出现在谷物、坚果中、棉花和其它人类的食品中或动物饲料中。农作物可能被一种或多种黄曲霉毒素污染：如黄曲霉B₁、B₂、G₁和G₂。黄曲霉B₁是最为频繁被检测出的毒素。其它毒素也有很高的检出率。黄曲霉毒素可以影响人类的健康，包括肝癌、黄曲霉毒素中毒、肝炎。动物是通过饲料中的黄曲霉毒素中毒，中毒的症状为死亡、生殖力下降、免疫力下降、产奶量或产蛋量减小。全世界许多国家的政府***部门都制定了对于人类的食品和动物饲料中黄曲霉毒素含量的标准。准确和快速的检测出日用品中黄曲霉毒素的含量是非常重要的。

用途

黄曲霉毒素是竞争酶联免疫反应定量检测，用来检测谷物、坚果中、棉花和其它人类的食品中或动物饲料中黄曲霉B₁、B₂、G₁和G₂的含量。

检测原理

黄曲霉总量试剂盒是直接竞争酶联免疫反应，包被在酶标板上的黄曲霉毒素的特殊抗体优化所有四种亚型的交叉反应。毒素萃取用70％甲醇。把萃取样品和酶标结合物加到酶标板中充分混合。萃取样品中毒素和酶标结合物竞争与酶标板中包被的特殊抗体反应，没有结合的物质被洗掉。加入底物后颜色变蓝。颜色的深浅和酶标结合物绑定的数量是正比与样品和标准中的黄曲霉毒素含量与和成反比。所以黄曲霉毒素含量越大颜色越潜。加入终止液后颜色从蓝到黄。用450nm酶标仪读取吸光度值。样品的OD值与标准的OD值比较看结果分析。

一、试剂盒包括

试剂盒中的试剂可保证完成96次测验所需要的,包括标准液，每个标样设置一个重复。

1) 封装好的微量酶标板（12条可拆），包被有鼠抗单克隆抗体直接使用，勿用水洗。

2) 稀释板没有包被，用作加酶标结合物、标准液和样品用。

3） 标准液6瓶：1.5ml /瓶 0ng/ml，0.2 ng/ml，0.5 ng/ml，1 ng/ml，2.0 ng/ml，4.0 ng/ml。

4） 酶标结合物 1×25ml。

5） TMB底物溶液1×15ml。

6） 反应终止液1×15ml可直接使用。

二．需要设备（试剂盒中未提供）

1．萃取程序

1）研磨及搅拌器

2）125ml容器

3）20克天平

4）100ml量桶

5）分析用甲醇：每个样品需要70ml。

6）蒸馏水或去离子水：每个样品需要30ml。

7）滤纸

8）漏斗

2．试验程序

1）100ul-200ul吸头

2）计时器

3) 洗瓶

4) 吸水的纸巾

5) 450nm酶标仪

三、注意事项

1． 所有试剂在使用前需要恢复室温（19℃－27℃）。

2． 试剂需要储存在（2℃－8℃），不要使用过期的试剂盒。不要冷冻试剂。

3． 不要重复使用盛试剂的容器，计算好每次试验需要试剂的体积。

4． 从开始到结束试验要保持同样的温度。

5． 调节样品的pH值到7.0（±1.0）。过碱或过酸会影响检测结果。

6． 不要吸食试剂或样品。

7． 标准溶液易燃，需要妥善保存。

8． 终止液含酸。不要接触到眼睛或皮肤，应立即用清水清洗。

9. 考虑到所有试剂、容器、装置都可能被黄曲霉毒素污染，所以在试验时带上手套和防护眼镜。

10. 所有试验用的试剂、容器、装置应妥善处理。

四、萃取程序

注意：样品收集应按照制定好的程序收集。

1． 配置萃取溶液（70％甲醇）：加30ml蒸馏水或去离子水到70ml甲醇中（分析用甲醇），每个样品需要100ml70％甲醇。

2． 把样品研磨成粉状。

3． 称20克样品加入100ml70％甲醇。样品与萃取液的比为1：5（重量/体积）

4． 在密封的容器中混匀或在搅拌器中最少混匀2分钟。

5． 用滤纸过滤5－10ml萃取液进行检测。

五、操作步骤

注意：建议用多道移液器进行试验。如果用单道移液器，建议每次试验做不超过16个样品（两条板孔）。

1． 所有试剂要恢复到室温（19-27℃）。

2． 把稀释板放到微孔板架上，把同等数量的酶标板放到另一个微孔板架上。

3． 吸200ul酶标结合物到所有稀释板中。

4． 用新吸头吸100ul标准液和样品到所有含酶标记物的稀释板中， 用移液器吸孔中液体至少3次以混匀液体。

记录所有标准和样品在板孔的位置。计算需要板孔的数量，标准和样品需做平行。没用的板孔要妥善保存。

5． 用新吸头从稀释板中吸100ul液体到酶标板中。室温（19-27℃）孵育15分钟。

6． 除去微孔板上的溶液，用250ul蒸馏水或去离子水洗板5次。

7． 在每次倒出洗液后，把板孔倒置，在纸巾上拍打几次，使废液全部倒出。

8． 计算好需要底物的体积（1ml/条或120ul/孔）放置在一个单独的容器中，每孔加100ul底物溶液。室温（19-27℃）孵育5分钟。

9． 计算好需要终止液的体积（1ml/条或120ul/孔）放置在一个单独的容器中，每孔加100ul终止液。次序和加底物的次序一样。

10.在450nm下读取吸光度值。

六、计算结果

1． 用标准液的OD值与0标准液的百分比绘制出标准曲线。未知的样品含量可以通过曲线得出含量。

2． 样品加入100ml70％甲醇。样品与萃取液的比为1：5（重量/体积），所以计算样品浓度时，要乘以5，所得值为样品中黄曲霉总量每克的实际浓度值，见下表。

标准溶液 ng/ml	样品 （ppb）
0.0 0.2 0.5 1.0 2.0 4.0	0.0 1.0 2.5 5.0 10.0 20.0

稀释后的样品标准曲线在1ppb-20ppb之间。如果样品中的实际浓度高于最大的标准浓度，应用适当的70％甲醇稀释样品重新做试验。注意计算最后的结果时要考虑稀释倍数。