【操作步骤】

1.RNA提取 

(1) 取疑似病料（空肠、小肠及其内容物等），用Hank’s液或PBS研磨成1：3悬液，在－20 ℃反复冻融3次，经3 000 r/min离心5 分钟，上清液再经12 000 r/min离心15分钟，上清液－70 ℃保存备用。

（2）取200uL上清液（或标准品Ｔ），移入新的1.5mL灭菌EP管中，加入200uLSR-I，漩涡振荡混合均匀，静置5min。

（3）加75uL TU-1，漩涡振荡混合均匀，10000r/min离心5 min。

（4）将上清转移到新的2 ml离心管（试剂盒内提供）中，加入300 uL 异丙醇（1%冰乙酸），上下倒置6-8次，混合均匀。

（5）将步骤4中的混合液移入制备管中，并将制备管置于同一2 ml离心管，10000 r/min离心1min。

（6）弃滤液，将制备管置回到2 ml离心管中，加500 uL SR-II，室温静置1min，10000 r/min离心1 min。

（7）弃滤液，将制备管置回到2 ml离心管中，加700 uL SR-Ⅲ，10000 r/min离心1 min。

（8）将制备管置回到2 ml离心管中，10000 r/min离心1 min。

（9） 将制备管置于洁净的1.5 ml离心管中（试剂盒内提供），在制备管膜中央加40 uL TU-2， 室温静置1 min。10000 r/min离心1 min洗脱。洗脱液即为模板，即用或-70℃冻存备用。

2.One-Step RT- PCR加样体系

3.反应程序

4.电泳

配制1%琼脂糖凝胶，取PCR产物5uL混合1uL TU-8，加样于凝胶孔中，同时在相邻孔加3uLTU-7，在120v 电压下，1×TAE液中电泳15分钟，在紫外成像仪下观察结果。

【结果判定】

在约720bp位置出现扩增带，猪传染性胃肠炎检测结果为阳性，在约240bp位置出现扩增带，猪流行性腹泻检测结果为阳性（如图）。                             

                                  1.DL2000 Marker     

                                  2.标准阳性片段