产品描述

有许多方法用于测量基因在组织和细胞中的表达量，包括Northern Blots、逆转录和PCR扩增（RT-PCR）、RNA酶保护分析、原位杂交、斑点印迹及核酸酶S1保护分析。在这些方法中，RT-PCR是最灵敏和最通用的方法。它能够用来确定转录物是否生成，评估表达水平，不需要构建和筛检出一个cDNA文库就可以克隆出cDNA产物。

两步法M-MLV RT-PCR系统是为从总RNA或mRNA中逆转录和PCR扩增得到特异目标RNA而设计的。这种1只管子2种酶的系统甚至可以为稀有RNA提供灵敏、快捷、可再现的分析。它采用M-MLV逆转录酶（Rnase H^-,点突变）。

操作步骤

一、cDNA第一链合成

    1.       RNA变性

按照如下配比将各组分加入到已除酶的微量离心管中：

primer:

Oligo(dT)12-18 (10pmol)

 or 25pmol randomprimers

or 10 pmole gene-specific primer (GSP)             1 μl

dNTP (10mM)                                  2 μl

RNase inhibitor (Rnasin)                          1 μl

Nuclease-Free Water                           11-x μl

RNA (1μg/μl)                                   x μl

65℃5min，降温到4℃

 

2.   上述变性后退火反应液14ul中加入以下：

5 x Reaction Buffer                            4 μl

M-MLV Revertase, Rnase H-, Point Mutant          1 μl

Total                                     20 μl

3.   混匀各组分并短暂温和离心；

4.   （此步使用随机引物时必选）30℃ 温浴10min；

5.   接着42℃ 温浴30-60min；

6.   95℃ 温浴5min终止反应；（长片段77度15min）

7.   4℃ 放置5min。

建议：每50 μl PCR反应体积中使用2-4 μl第一链cDNA产物。

 

二、 PCR操作步骤

1.         在冰浴的管子中准备以下反应组分：

10x reaction buffer (Mg²⁺ plus)                        5μl

primer: up steam                                   1μl

primer: down stream                                1μl

10mM dNTP mix                                    1μl

The first strand cDNA template                        2μl

Taq DNA Polymerase                              0.6-0.8μl

DDW Water                                    up to 50μl

2.         执行PCR程序

94°C    5min

94°C ,30s;  45-60°C, 45s;  72 °C, 1 min          for 25-35 cycles

72°C, 10 min  4°C ,forever  

注意：

1.         从Total RNA中预先分离出polyA RNA不是必须步骤，但如果这样做可以提高最终产物的产量和纯度。

2.       RNA样品必须去除基因组DNA污染。

3.       以oligo(dT)₁₈为引物的反应通常不要求优化，而使用随机引物的反应不同，随机引物与RNA的比率取决于反应中合成的cDNA的平均长度。随机引物/RNA的比率增加，将会增加短片段(~500 bp) cDNA的产量，反之，降低比率将增加长片段的产量。

4.       由高GC含量mRNA二级结构产生的问题，可以通过提高反应温度至45℃来改善，但由于M-MLV RT对热敏感，这样做也会相应降低酶的活性从而导致cDNA合成产量下降。

5.       若要分析反应产物cDNA，可以采用[³²P]做***性同位素示踪，方法如下：在预先加入M-MLV RT的反应混合物中添加10μCi [α-³²P]dNTP (e.g., dATP)，用1 μl 0.5M EDTA终止反应并保持冰浴。

6.       合成的cDNA须保存在-20℃。

 

质量控制

试剂盒中所有组分均经过第一链cDNA合成反应检测，以多聚腺核苷酸RNA转录物作对照模板（含特异对照引物、oligo(dT)₁₈和随机引物）。

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