cDNA第一链合成试剂盒

(目录号HS0611)

产品包装

试剂盒组成	25次HS0611-1	50次HS0611-2
SuperRT, 200 U/ul）	25 ul	50 ul
Primer Mix	60 ul	120 ul
5 × RT Buffer	120 ul	240 ul
dNTP(2.5 mM each)	120 ul	240 ul
DEPC-ddH2O	1 ml	2 ml

保存条件

-20℃

产品简介

MMLV逆转录酶（MMLV Reverse Transcriptase（RNase H-））是M-MLV逆转录酶的突变型，点突变去除了RNase H的活性中心，使RNase H的活性降低，减少了逆转录反应中RNA的降解，使cDNA第一链的得率增加，更容易获得全长cDNA，能以RNA或单链DNA为模板起始合成互补的DNA链。

产品特点

 1. 全长的第一链cDNA产量高，最长可合成5kb的cDNA。

2. 试剂盒提供Oligo dT  Primer 和Random Primer p(dN)6两种引物的混合物。

 3. 逆转录反应的模板总RNA范围可以在50 ng ~ 5 ug之间。

产品应用

1.适合于从各种组织中提取的总RNA或mRNA为模板合成cDNA第一链。

2.实时荧光定量RT-PCR。

3.半定量PCR反应。

4.3’-和5’-RACE等。

使用方法

（注意：1 ng ~ 5 ug总RNA可建立20 μl反应体系，如果总RNA量大于5 ug，请按比例扩大反应体系）

ⅰ 逆转录操作步骤

1. 将 RNA 模板、引物、dNTP Mix、RT Buffer、SuperRT 和RNase-Free Water 溶解并置于冰上备用。

2. 根据以下表格配置反应体系，总体积为20 ul。

试剂	20 ul反应体系	终浓度
dNTP Mix, 2.5 mM each	4 ul	500 uM each
Primer Mix	2 ul
RNA 模板	X ul	50 pg ~ 5 ug
5 × RT Buffer	4 ul	1 ×
SuperRT, 200 U/ul	1 ul
DEPC-ddH2O	Up to 20 ul

（注意：若起始RNA的量小于50 ng，则建议加入RNA酶抑制剂（RNasin））

3. 涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

4. 42℃孵育30 ~ 50 min，85℃孵育5 min。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。

5. 逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。

ⅱ 若逆转录效率低，或RNA 模板二级结构复杂、GC 含量高时，建议采用以下逆转录操作步骤

1. 将 RNA 模板、引物、dNTP Mix、RT Buffer、SuperRT 和RNase-Free Water 溶解并置于冰上备用。

2. 根据以下表格配置反应体系，总体积为15 ul。

试剂	15 ul反应体系	终浓度
dNTP Mix, 2.5 mM each	4 ul	500 uM each
Primer Mix	2 ul
RNA 模板	X ul	50 pg ~ 5 ug
DEPC-ddH2O	Up to 15 ul

3. 70℃孵育10 min，迅速冰浴2 min。

4. 短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

5. 继续向以上反应液中加入4 ul 5 × RT Buffer。

 (注意：若起始RNA 的量小于50 ng，则建议加入RNA 酶抑制剂（RNasin）)

6. 轻轻吹打混匀，加入1 ul SuperRT（200 U/ul），混匀，42℃孵育50 min。

7. 85℃孵育5 min。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。

8. 逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。

 

 

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