中国<br>试剂级别：分子生物学级Brand,null 产品货号： xy1120403Item#, HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix(Rox Provided Seperately)<br>英文名称： HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix(Rox Provided Seperately)

HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix(Rox Provided Seperately)产品描述

PCR SYBR^® Green Master Mix是2×浓缩的实时定量PCR扩增的预混合溶液，专为高特异性、高灵敏度实时定量PCR而设计。Mix中含有热启动的\DNA Polymerase，SYBR^® Green I，dNTP Mix，Mg²⁺。使用时仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR，大大简化操作过程，缩短操作时间，降低污染。能有效抑制非特异性的PCR扩增，从而显著提高PCR反应的扩增效率，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。

本产品针对不同厂商的实时荧光定量PCR仪，分别提供不同浓度的Rox参比液（High Rox/Low Rox），用于校正孔与孔之间的荧光信号误差。

HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix(Rox Provided Seperately)High Rox适用仪器：

Thermo Scientific PikoReal Cycler

HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix(Rox Provided Seperately)运输与保存方式

冰袋运输，-20℃避光储存，有效期1年。

尽量避免反复冻融，如每次使用量较少，推荐小份分装使用。

操作流程

【注】：由于本品检测灵敏度极高，即使空气中微量的DNA气溶胶都可以引起污染，进而导致实验失败。因此反应体系配制时请于超净工作台内进行，配制过程中请使用干净灭菌枪头、反应管，条件容许的实验室推荐使用专用的移液枪，避免交叉污染。推荐使用带滤芯的枪头。

1．上下颠倒混，避免剧烈震荡以免产生过多气泡。Mix轻微离心后即可使用。

2．qPCR反应体系配制^*

试剂	体积1（50 μl）	体积2（20 μl）
Hieff^TM qPCR SYBR^® Green Master Mix	25 μl	10 μl
Forward Primer（10 μM）	1 μl	0.4 μl
Reverse Primer（10 μM）	1 μl	0.4 μl
50×High or Low Rox	1 μl	0.4 μl
模板DNA	X μl	X μl
无菌超纯水	Up to 50 μl	Up to 20 μl反应体系中各成分的用量可根据以下原则自行调整，

a）此处根据仪器类型，不添加或添加相应量的50×high Rox或者50×low Rox。

b）反应体系中引物浓度一般在0.1-1.0 μM之间，一般引物终浓度为0.2 μM扩增效果较好；

c）cDNA模板的体积不要超过反应体积的1/10；

		预变性
95℃	10 sec	循环反应（40 cycles）
60℃	30 sec^a	循环反应（40 cycles）
95℃	15 sec	融解曲线^b
60℃	60 sec
95℃	15 sec

【注】：a: 延伸时间需要根据定量PCR仪所需要的数据采集最短时间限制自行调整。使用ABI 7700和7900HT时至少30s；使用ABI 7000和7300时至少31s；使用ABI 7500时至少34s；使用ABI StepOne Plus^TM时至少10s。

；Ct值大于35时， Real Time PCR检测无效，目标基因无表达；当Ct值介于32-35之间时，需要至少三个重复才能判断目标基因是否表达。

2）如果反应特异性好，无非特异性扩增产物产生，无引物高级结构，则融解曲线应该是单峰曲线，此时定量结果有效；若融解曲线出现显著多峰，则定量结果无效，请优化条件重新进行定量实验。（引物设计不合理而导致的引物二聚体在融解曲线内峰值一般位于75℃左右，如该峰显著请更换引物再次实验）。

3）使用本品进行绝对定量需自行绘制标准曲线；进行相对定量可根据下述公式计算目标基因表达情况：

设定Ct^A1为1号样本目标基因Ct值，Ct^B1为1号样本内参基因Ct值；Ct^A2为2号样本目标基因Ct值，Ct^B2为2号样本内参基因Ct值，则1号样本和2号样本目标基因表达水平比值可粗略计算为（2^-^△△^Ct法）：

△△Ct =（Ct^A2-Ct^B2）-（Ct^A1-Ct^B1）= X，则2号样本内目标基因的表达水平为1号样本内的2 ^-X 倍。

【注】：上述计算方法是假定扩增效率为100% (每个循环过后产物量为前一循环产物量乘以2)，如实际扩增效率不为100%，需根据实际扩增效率修改计算公式。例如：目标基因和内参基因扩增效率为0.90，则计算公式应该修正为(1+0.90)^-^△△^Ct。

引物设计指南

1）扩增产物长度100bp-150bp为佳。重要！

2）引物长度17 bp-25 bp最好。太短的引物容易导致扩增效率降低，太长的引物会导致引物高级结构出现几率增加；

8）尽量避开T/C或者A/G的连续结构；

9）避开引物内部或者两条引物之间有3个碱基以上的互补序列，二条引物之间的3’端避开有2个碱基以上的互补序列；

10）引物设计完毕使用NCBI BLAST功能检索核对引物特异性，以避免非特异性扩增产生。

标准曲线斜率介于 -3～-3.5之间

PCR扩增效率（E）介于0.9～1.2之间。

2）重复性确认：

重复管之间的STD＜0.2

3）特异性确认：

扩增产物融解曲线无明显非特异性扩增产物/引物二聚体杂峰（必要时请进行琼脂糖电泳进行确认）。