HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (No Rox Plus)产品描述

 ^TM qPCR SYBR^® Green Master Mix(No Rox Plus)是2×浓缩的实时定量PCR扩增的预混合溶液，专为高特异性、高灵敏度实时定量PCR而设计。Mix中含有热启动的NA Polymerase，SYBR^® Green I，dNTP Mix，Mg²⁺。使用时，仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR，大大简化操作过程，缩短操作时间，降低污染。可有效抑制非特异性的PCR扩增，从而显著提高PCR反应的扩增效率，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。

 HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (No Rox Plus)操作流程

【注1】：由于本品检测灵敏度极高，即使空气中微量的DNA气溶胶都可以引起污染，进而导致实验失败。因此反应体系配制时请于超净工作台内进行，配制过程中请使用干净灭菌枪头、反应管，条件容许的实验室推荐使用专用的移液枪，避免交叉污染。推荐使用带滤芯的枪头。

【注2】：由于本品中含有荧光染料SYBR^® Green I，因此无论保存还是配置反应体系时都应该尽量避免强光照射。

1．使用前务必充分混匀Mix，混匀时避免剧烈震荡以免产生过多气泡。Mix轻微离心后即可使用。

2．qPCR反应体系配制^*

试剂	体积1（50 μl）	体积2（20 μl）
HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (No Rox Plus)	25 μl	10 μl
Forward Primer（10 μM）	1 μl	0.4 μl
Reverse Primer（10 μM）	1 μl	0.4 μl
模板DNA	X μl	X μl
无菌超纯水	Up to 50 μl	Up to 20 μl

【*】：

a）反应体系中引物浓度一般在0.1-1.0 μM之间，一般引物终浓度为0.2 μM扩增效果较好；

b）cDNA模板的体积不要超过反应体积的1/10；

c）扩增产物长度请选择范围内，尤其推荐100 bp-150 bp之间；

d）qPCR灵敏度极高，建立反应体系时加入模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响。 因此如仪器允许，推荐您使用50 μl反应体系，并且将模板稀释后（如稀释至5μl/样本）加入反应体系中，这样可以有效提高实验的重复性。

3．PCR 反应条件

本产品可以用三步法进行，也可以用两步法程序进行PCR扩增反应。ieff^TM DNA Polymerase需要热激活处理以恢复酶活性，请至少设置PCR反应预变性条件为95℃ 5分钟。如果模板中GC含量较高，可将预变性时间延长至10分钟。

【三步法程序】

95℃	5 min	预变性
95℃	10 sec	循环反应（40 cycles）
55-60℃	20 sec
72℃	20 sec
95℃	15 sec	融解曲线b
60℃	60 sec
95℃	15 sec

 

【两步法程序】

	5 min	预变性
95℃	10 sec	循环反应（40 cycles）
60℃	30 seca
95℃	15 sec	融解曲线b
60℃	60 sec
95℃	15 sec

【注】：a: 两步法延伸时间需要根据定量PCR仪所需要的数据采集最短时间限制自行调整。

b: 融解曲线采集程序可根据您使用仪自行调整，通常情况下使用仪器默认程序即可。

t值落在20-28之间定量最为准确。如果Ct值太小，请稀释模板后重新进行试验；Ct值大于35时，       Real Time PCR检测无效，目标基因无表达；当Ct值介于32-35之间时，需要至少三个重复才能判断目标基因是否表达。

2）如果反应特异性好，无非特异性扩增产物产生，无引物高级结构，则融解曲线应该是单峰曲线，此时定量结果有效；若融解曲线出现显著多峰，则定量结果无效，请优化条件重新进行定量实验。（引物设计不合理而导致的引物二聚体在融解曲线内峰值一般位于75℃左右，如该峰显著请更换引物再次实验）。

3）使用本品进行绝对定量需自行绘制标准曲线；进行相对定量可根据下述公式计算目标基因表达情况：

设定Ct^A1为1号样本目标基因Ct值，Ct^B1为1号样本内参基因Ct值；Ct^A2为2号样本目标基因Ct值，Ct^B2为2号样本内参基因Ct值，则1号样本和2号样本目标基因表达水平比值可粗略计算为（2^-△△Ct法）：

△△Ct =（Ct^A2-Ct^B2）-（Ct^A1-Ct^B1）= X，则2号样本内目标基因的表达水平为1号样本内的2 ^-X 倍。

【注】：上述计算方法是假定扩增效率为100% (每个循环过后产物量为前一循环产物量乘以2)，如实际扩增效率不为100%，需根据实际扩增效率修改计算公式。例如：目标基因和内参基因扩增效率为0.90，则计算公式应该修正为(1+0.90) ^-△△Ct。

引物设计指南

1）扩增产物长度100bp-150bp为佳。重要！

含量不均匀的区域；

8）尽量避开T/C或者A/G的连续结构；

9）避开引物内部或者两条引物之间有3个碱基以上的互补序列，二条引物之间的3’端避开有2个碱基以上的互补序列；

10）引物设计完毕使用NCBI BLAST功能检索核对引物特异性，以避免非特异性扩增产生。

 

标准曲线相关系数（R²）＞0.98

标准曲线斜率介于 -3～-3.5之间

PCR扩增效率（E）介于0.9～1.2之间。

2）重复性确认：

重复管之间的STD＜0.2

3）特异性确认：

扩增产物融解曲线无明显非特异性扩增产物/引物二聚体杂峰（必要时请进行琼脂糖电泳进行确认）。