英文名称： Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis
试剂级别： 分子生物学级
Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit多点突变试剂盒产品描述是基于Hieff CloneTM快速克隆技术的定点突变系统。使用本试剂盒，可一次性向目标质粒上三至五个不连续位（相距超过50bp）同时引入定点突变。该试剂盒由两个模块组成：HieffTM II Pfu DNA Polymerase扩增模块和Hieff CloneTM快速克隆模块。HieffTM II Pfu DNA Polymerase超高的保真度显著降低了扩增过程中引入新突变的可能性，其卓越的长片段扩增能力，广泛适用于长度小于20 kb的任何质粒扩增。Hieff CloneTM快速克隆系统利用高效的同源重组反应替代传统的退火成环反应。因此使用Hieff MutTM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit进行DNA定点突变时，引物设计更加灵活，且扩增反应以指数方式进行，极大减少了模板使用量，有利于原始甲基化模板的彻底降解。
Hieff MutTM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit中的重组酶Exnase MultiS经过优化，专门针对多碱基进行定点突变。此外，如扩增产物特异，其DpnI消化产物可不进行DNA纯化而直接用于重组反应。高度优化的反应缓冲液、快捷的操作流程以及极高的成功率，使得Hieff MutTM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit成为DNA多点突变首选试剂盒。
Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit多点突变试剂盒应用范围
DNA定点突变
【注】：如使用本品对质粒进行定点突变，请使用甲基化酶无缺陷的宿主菌 (例如Top10、DH5α、JM109)扩增原始质粒！
Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit多点突变试剂盒产品组成
冰袋（wet ice）运输。产品-20 ºC保存。有效期1年。
不连续多碱基（相距超过50bp）定点突变实验流程
实验流程概览
Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit多点突变试剂盒4.2 重组反应
1） 将上述体系置于37℃反应 30 min。
2） 待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5 min。
3） 之后，反应产物可直接进行转化；也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。
4. 反应产物转化、涂板、克隆鉴定
1） 取20 μl冷却反应液，加入到200 μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30 min。
2） 42℃热激45～90秒，冰水浴孵育2 min。
3） 加入900 μl SOC或LB培养基，37℃孵育10min充分复苏。
4） 37℃摇菌45 min。
5） 取100 μl菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。
【注】：我们推荐您使用转化效率>108 cfu/μg的感受态细胞。如果感受态转化效率<108 cfu/μg (例如用CaCl2法新鲜制备的感受态转化效率通常在106-107 cfu/μg之间)，请将培养菌液在5,000 rpm离心3 min收集菌体，用100 μl LB培养基重悬后全部涂板。
Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit多点突变试剂盒注意事项
1） 引物设计时5’端反向互补区尽量选择无重复序列，且GC含量比较均匀的区域。当这一区域内GC含量在40%～60%范围之内时，重组环化效率将达到最大。如这部分区域GC含量高于70%或者低于30%，重组环化效率会受到较大影响。
2） 当两突变位点相距小于50bp时，应将其视为一个突变位点，将两突变引入同一条/对引物进行实验。
3） DpnI只能识别甲基化DNA，请务必使用从甲基化酶无缺陷的宿主菌中扩增的质粒作为PCR模板。
4） 质粒PCR扩增结果需高度特异，杂带较多会影响实验结果。
5） 重组反应体系中应尽量避免金属络合剂(如EDTA)的带入。因此，建议将DNA纯化产物溶解在pH8.0的ddH2O中保存(常规胶回收试剂盒中的洗脱液可用pH8.0的ddH2O替代)，请勿使用TE进行DNA保存。
6） 冷却后的反应产物应在1h内进行转化，且转化前保持在冰水浴中。如需储存，于-20℃冻存。尽量避免室温较长时间放置或4℃长期储存。
7） 反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率。另外，当转化的DNA浓度太高时，会抑制转化反应。将重组反应产物稀释5倍后取1/5进行转化。
8） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。