中国<br>试剂级别：分子生物学级Brand,null 产品货号： xy1110184Item#, Hieff™ I Reverse Transcriptase 第一代耐热逆转录酶<br>英文名称： Hieff™ I Reverse Transcriptase

Hieff™ I Reverse Transcriptase 第一代耐热逆转录酶产品描述^M I Reverse Transcriptase是在M-MLV (RNase H^-) Reverse Transcriptase基础上经过多点突变得到的全新逆转录酶。Hieff^TM Reverse Transcriptase热稳定性提高，在50℃下活性最高，且可耐受高达55℃的反应温度，适用于具有二级结构的RNA模板的逆转录，能稳定可靠地合成cDNA。该酶与模板的亲和力增强，可获得更多全长的cDNA，并可检测到低至1 pg的总RNA，特别适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。此外，Hieff^TM I Reverse Transcriptase降低了逆转录过程的错配率，提高了克隆的保真度。

Hieff™ I Reverse Transcriptase 第一代耐热逆转录酶产品组分

Oligo(dT)为模板/引物，在37℃，10分钟内，掺入1 nmol的dTTP为酸不性溶物质所需要酶量定义为1个活性单位（U）。活性定义

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。收到产品后放到-20 ºC保存。

Hieff™ I Reverse Transcriptase 第一代耐热逆转录酶质量控制

核酸外切酶残留检测：200 U本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在37 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。

孵育1小时，RNA电泳谱带不发生变化。

功能检测1：逆转录体系中加入200 U本品，以500 ng Hela cell total RNA为模板，Oligo(dT)₁₈为引物，50 ºC反应45分钟。取10% cDNA产物进行PCR扩增DNCH基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的5.6 kb条带。

功能检测2：逆转录体系中加入200 U本品，以100 pg Hela cell total RNA为模板为引物，50 ºC反应30分钟。取10% cDNA产物进行PCR扩增β-actin基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的550 bp条带。

注意事项

1）请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证RNase free，以防止RNase污染。

2）为保证逆转录成功，建议使用高质量的RNA样本。

3）为了您的健康，实验操作时请穿实验服和带一次性手套。

Hieff™ I Reverse Transcriptase 第一代耐热逆转录酶应用实例

1. RNA模板变性

【注意】RNA模板变性有助于打开二级结构，可在很大程度上提高第一链cDNA的产量。对于长度超过3 kb的cDNA片段，请务必进行此步操作。对于GC含量很高（50%以上）建议也进行此步操作。

RNase free离心管中配制如下混合液【表1】，65℃ 加热5 min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2 min。

表1 模板RNA变性混合体系

RNase free ddH₂O

to 13 μl

Oligo(dT)₁₈(0.5 μg/μl)

or Random hexamers(0.1μg/μl)

or Gene Speicific Primers(2 μM)

1 μl

模板RNA

Total RNA:50 ng-5μg;

Poly(A)⁺ RNA: 5-500 ng

2. 第一链cDNA合成体系

在RNase free离心管中配制如下混合液【表2】：

表2 第一链cDNA合成反应体系

上一步的模板RNA变性混合体系	13 μl
5×Hieff^TM I Reaction Buffer	4 μl
dNTP Mixture(10 mM each)	1 μl
RNase inhibitor (40 U/μl)	1 μl
Hieff^TM I Reverse Transcriptase(200 U/μl)	1 μl

3. 按照下列条件进行第一链合成反应：

使用Oligo(dT)₁₈

65℃^**

15 min

[*]：当模板GC含量高（50%以上）或者二级结构复杂，可将逆转录温度提高到55℃。对于Oligo(dT)₁₈引物，要在55℃逆转录。需要先在42℃孵育5min，然后在55℃孵育50min。

[**]：65℃加热15min的目的是失活逆转录酶。

使用Random hexamers

25℃	10 min
50℃^*	50 min
65℃^**	15 min

[*]：当模板GC含量高（50%以上）或者二级结构复杂，可将逆转录温度提高到55℃。

[**]：65℃加热15min的目的是失活逆转录酶。

使用Gene Speicific Primers

50℃^*	50 min
65℃^**	15 min

[*]：当模板GC含量高（50%以上）或者二级结构复杂，可将逆转录温度提高到55℃。

[**]：65℃加热15min的目的是失活逆转录酶。

得到的第一链cDNA反应产物可立即用于PCR反应，或在-20℃保存，并在半年内使用；长期存放建议分装后在-80℃保存。cDNA应避免反复冻融。用于PCR反应的cDNA产物体积建议取PCR反应体积的1/10-1/5。