Wehelp （Golden）Eva Mixture是专用于染料法（Eva Green）实时荧光定量 PCR的预混体系，浓度为2×，包含（Golden）Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、Eva Green荧光染料和Mg²⁺。配制好的预混合液操作简单便捷、能有效缩短操作时间，减少移液过程中混入的污染。

    Eva Green染料是一种核苷酸荧光染料，有较好的热稳定性与水解特性，更加便利地用于各种扩增，包括qPCR、熔解曲线分析、高分辨率熔解曲线分析（HRM）、常规溶液的DNA量化及毛细管电泳等，适用于各种仪器设备。与SYBR Green Ӏ 能快速通过细胞膜提高突变性不同的是，Eva Green染料不能穿透细胞膜，因此不具突变性与细胞毒性。

   Molebio-007使用的热启动酶Golden Taq DNA Polymerase在常温下没有聚合酶活性，有效避免在常温条件下由引物和模板非特异性结合或引物二聚体而产生的非特异性扩增，能显著提高扩增效率，PCR反应的灵敏度更高、特异性更强。

 

Eva Green优势（与SYBR Green Ӏ 相比）

Ø 能有效抑制非特异性扩增。

Ø 采用更高浓度的染料，荧光信号更强。

Ø 高浓度的Eva Green能有效减少PCR反应末端常见的染料重新分布问题，熔解曲线分析更加精确。

Ø 优化qPCR反应和熔解曲线分析，产量高、重复性好。

Ø 适用于荧光定量PCR检测，能够准确地对目的基因进行定量和检测。

 

注意事项

Ø -20℃避光保存，避免污染。

 

Ø 避免反复冻融，反复冻融可能使产品性能下降。

Ø 使用前，需上下轻轻颠倒混匀，防止染

    料吸附在瓶壁上，经短暂离心后使用。

Ø 在荧光定量PCR仪上进行实时PCR，并在退火或延伸步骤记录荧光信号。

Ø 本产品未添加ROX校正染料。

Ø 本产品不能用于探针法荧光定量PCR。

 

PCR反应体系

试剂	50 μl 反应体系	终浓度
2× Golden Eva Mixture	25 μl	1×
10 μM Forward Primer	1 μl	0.2 μM (0.05-1 μM)
10 μM Reverse Primer	1 μl	0.2 μM (0.05-1 μM)
Template DNA	2 μl
ddH2O	to 50 μl

 

PCR循环反应条件

步骤	循环次数	温度	时间
1	1	96℃	2分
2	35~40	95℃	15 秒
		60~64℃ (信号采集点)	1分
3	1 (熔解曲线)	95℃	15秒
		60℃	1分
		95℃	15秒
		60℃	15秒

注意：1）为抑制非特异性反应，Molebio-007

 

中添加了抗 Taq DNA 多聚酶的单克隆抗体进行热启动。此方法的优点是酶活力的释放极快，在 2分钟内即可完成预变性。各循环的变性步骤只需考虑核酸变性所需的时间进行设定即可。如果使用 LightCycler^TM等高速 PCR 仪，更能显示出其缩短时间的优越性。

 

反应条件优化

u 引物浓度：一般以引物浓度0.2 μM为最佳浓度，终浓度0.05-1.0 μM为参考范围。降低引物浓度提高反应特异性；增加引物的浓度提高扩增效率，优化反应体系。

u 退火温度：升高退火温度是常用的提高反应特异性的方法，以60-64℃作为参考范围。若因Tm值较低引起实验结果不佳，可采用三步法进行PCR扩增，退火温度的参考范围为56℃-64℃。

u 延伸时间：推荐使用两步法PCR，延伸时间设置为1 min。若提高扩增效率，可将延伸时间增加，或尝试三步法PCR。

 

三步法荧光定量PCR

步骤	循环次数	温度	时间
1	1	96℃	2分
2	35~40	95℃	15 秒
		56~64℃	30秒
		72℃ (信号采集点)	32秒
3	1 (熔解曲线)	95℃	15秒
		60℃	1分
		95℃	15秒
		60℃	15秒