CPT高效转染试剂盒

 

保存

本试剂盒可在室温（15-25℃）保存三个月，4℃保存一年，负20℃长期保存。

产品说明

1 本试剂盒适用于病毒包装和蛋白表达瞬时转染。

2 转染可在100mm培养皿、60mm培养皿和6孔板中进行。

3 细胞接种密度不低于50%融合度，最佳的接种密度是在转染时细胞的融合度达90%以上。接种密度因所采用的细胞系和细胞的倍增时间而有所不同，一般来讲，细胞的接种密度为3-5 × 10⁶/100mm培养皿，5-8×10⁵/60mm培养皿或6孔板中为3-5 ×10⁵/孔。

试剂盒组成

Components	Volume
Buffer A	50ml
Buffer B	5ml

操作步骤

使用前准备好无菌的超纯水，转染试剂在使用时预热至常温。

第1d：转染前细胞准备期

转染前一天接种适量细胞至100mm培养皿、60mm培养皿或六孔板中，于37℃ CO₂培养箱中过夜培养。

第2d：转染

1转染前3~4h 将培养液换为无抗性的完全培养基。

2 转染混合物

先准备两个无菌干净的离心管，分别标上A和B；

  注意：B管一定要先加H₂O，再加质粒DNA，最后加Buffer B轻微混匀。

3 用移液枪将B管中的混合物混匀后缓慢逐滴加入A管中，换一吸头用气泡法混匀转染混合物，吹气泡时要慢且需在2min内完成，然后室温静置30min。

4 逐滴加入转染混合物到细胞培养板中，轻轻混匀后放入37℃ CO₂培养箱中培养4-6h后换液或过夜但时间不得超过16h。

第3d：换液

培养液换为含双抗的新鲜完全培养基，于37℃ CO₂培养箱中继续培养24-48h。

第4d：转染效果观察

换液24h后为荧光标记载体转染效果的最佳观察时期。若包装慢病毒时，可第一次收集病毒液，放于4℃中，并添加完全培养基继续培养；若包装腺病毒当细胞融合度达100%时可正常传代。

第5d：收集上清液或细胞

包装慢病毒时收集上清液

1 用吸管收集慢病毒上清液；

2 与前一天收集的上清液混合后1000rpm或230×g离心5min弃细胞碎片；

3 用0.45μm滤器过滤上清；

4 进一步纯化和浓缩病毒。

包装AAV时收集细胞

1 用吸管将培养瓶中的细胞吹落，收集至离心管中；

2 1000rpm或 230×g离心5min，弃上清；

3 进一步纯化和浓缩病毒。

当转染用于蛋白瞬时表达时，一般于转染后48-72h收集细胞或者上清进行蛋白表达检测。

1分泌型蛋白：离心收集上清进行蛋白检测，必要时需浓缩蛋白。

2非分泌型蛋白：

1） 吸去培养液，用PBS洗涤细胞两次；

2） 用细胞刮将细胞从培养瓶上刮落下来；

3） 转移细胞液至15ml离心管中于1000rpm离心5min；

4） 用PBS重悬细胞，转入另一无菌离心管中；

5） 1000rpm 或230×g离心5min；

6） 弃上清，沉淀置于-80℃中备用。

注意事项：

1 气泡法混匀转染体系时操作一定要温和。

2 换液时不要使细胞漂浮。