硫酸卡那霉素
英文名称: Kanamycin Sulfate
型号:null    产品货号: 60206YB10
价格:请致电:010-57128832,18610462672
品牌: 中国/美国
试剂级别: 分子生物学级

 硫酸卡那霉素

 产品信息

产品名称

产品编号

规格

储存

价格(元)

Kanamycin Sulfate 硫酸卡那霉素

60206YB10

10 g

室温干燥保存

 

 硫酸卡那霉素产品描述

硫酸卡那霉素(Kanamycin sulfate)是一种氨基糖苷类抗生素,对革兰氏阳性菌和阴性菌及支原体都有抑制作用。作用机制在于靶向结合细菌70S核糖体亚基,从而抑制核糖体易位和引起错误编码进一步干扰蛋白质合成。硫酸卡那霉素可用在细胞培养中抑制细菌污染。分子生物学研究中,它常用来选择性筛选成功转化卡那霉素抗性基因(kan gene)的细菌克隆;也常用于农杆菌介导的转化实验,选择性筛选携带npt IIAPH3)基因的植物组织。本品达到USP级别,易溶于水(50 mg/ml),需过滤除菌后使用,推荐工作浓度为30-50 µg/ml

 硫酸卡那霉素产品性质

中文名称(Chinese synonym

单硫酸卡那霉素;硫酸卡那辛;

英文名称(English synonym

Kantrex; Kan; Kanamycin A;

CAS号(CAS NO.

25389-94-0

分子式(Molecular Formula

C18H36N4O11·H2SO4

分子量(Molecular Weight

582.58

外观(Appearance

白色或类白色粉末

活力(Potency, dry basis

≥750 µg/mg

溶解性(Solubility

溶于水(50 mg/ml),几乎不溶于乙醇,氯仿,丙***

结构式(Structure

 硫酸卡那霉素运输与保存方法

室温运输。粉末室温干燥保存。母液(50 mg/ml)过滤除菌4℃保存,-20℃可长期保存。

注意事项

1) 卡那霉素加入琼脂培养基上后,平板需要密封以防止水分丢失,4最多可放1个月。若平板不密封,水分丢失后会引起卡那霉素降解,活性降低。

 

2)为了您的安全和健康,请穿实验服并带一次性手套操作。

酶切消化制备
环状质粒
加入失活内切酶后直接使用
胶回收
PCR制备
扩增特异
环状质粒
DpnI消化后直接使用(降解扩增模板)
胶回收或DpnI消化后胶回收
预线性化质粒、基因组、cDNA
直接使用
胶回收
有明显非特异性扩增
胶回收
【注】:直接使用酶切产物或扩增产物进行重组反应时,使用体积不应超过4μl(重组反应总体积的1/5)。
2. 制备PCR产物
2.1设计扩增引物
Hieff CloneTM引物设计总的原则是:通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列,使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp~25 bp)。
正向扩增引物设计方式:
5’——上游载体末端同源序列+基因特异性正向扩增序列——3’
反向扩增引物设计方式:
3’——基因特异性反向扩增序列+下游载体末端同源序列——5’
基因特异性正/反向扩增序列即常规插入片段正/反向扩增引物序列;
上游/下游载体末端同源序列为线性化克隆载体最末端序列(用于同源重组)。
以pUC18作为克隆载体为例,引物设计方案如图二所示。
 
 
 


 
图二 重组引物设计方案
【注】:如最终引物长度超过40bp,我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化,可提高克隆成功率。计算扩增引物退火温度时,只需计算基因特异性扩增序列的Tm值,载体末端同源序列不应参与计算,为了得到高效率克隆,建议Tm≥48
2.2 插入片段PCR扩增
插入片段可用任意PCR酶 (Taq酶或高保真酶) 扩增,无需考虑产物末端有无A加尾 (重组过程中将被去除,在最终载体中不会出现)。我们推荐您使用高保真聚合酶进行扩增(HieffTM Pfu DNA Polymerase,Cat No. 10113ES60),以减少扩增突变的引入。
PCR结束后,取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产量和特异性。Hieff CloneTM重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此,如扩增模板不是与克隆载体抗性相同的环状质粒,且PCR产物电泳条带单一,扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。
PCR扩增产物DNA纯度较低,直接使用进行重组反应时,重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此,在进行较大片段 (>5 kb) 克隆实验时,我们推荐您使用高质量的试剂盒对扩增产物进行胶回收纯化以提高DNA纯度。插入片段扩增产物的使用方式可查阅表二。
表二:扩增产物推荐使用方式
PCR扩增情况
PCR模板类型
快速实验方案
最佳实验方案
扩增特异
与克隆载体抗性相同的环状质粒
DpnI消化后直接使用*
胶回收或DpnI消化后胶回收
预线性化质粒、基因组、cDNA
直接使用
胶回收
有明显非特异性扩增
胶回收
【注】:直接使用扩增产物进行重组反应时,使用体积不应超过4μl(重组反应总体积的1/5)。
*当线性化克隆载体为酶切制备时,插入片段扩增产物经DpnI消化结束后应置于85加热20 min将DpnI 失活,以避免重组反应时残留DpnI 对克隆载体的降解。
3. 重组反应
3.1 配制反应体系
于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁,可通过短暂离心使其沉入管底。
ddH2O Up to 20 μl
2×Hieffclone Enzyme Premix 10 μl
线性化克隆载体 50~200 ng
插入片度扩增产物 20~200 ng
Hieff CloneTM重组反应体系最适克隆载体使用量为0.03 pmol;最适克隆载体与插入片段摩尔比为1:21:3,即最适插入片段使用量为0.060.09pmol。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得:
最适克隆载体使用量 = [0.02×克隆载体碱基对数]ng (0.03 pmol)
最适插入片段使用量 = [0.04×插入片段碱基对数]ng (0.06 pmol)
or = [0.06×插入片段碱基对数]ng (0.09 pmol)
例如,将长度为2 kb的插入片段克隆至长度为5 kb的克隆载体时,克隆载体的最适使用量应为:0.02 × 5000 = 100 ng; 插入片段最适使用量应为:0.04 × 2000 = 80 ng。


【注】:  当插入片段≤200bp时,最佳最适克隆载体与插入片段摩尔比为≥1:5。
 当插入片段长度大于克隆载体时,最适克隆载体与插入片段使用量的计算方式应互换,即将插入片段当做克隆载体/克隆载体当做插入片段进行计算。
 线性化克隆载体的使用量应在50~200 ng之间;插入片段扩增产物的使用量应在20~200 ng之间。当使用上述公式计算DNA最适使用量超出这个范围时,直接选择最低/最高使用量即可。例如,插入片段长度为100 bp,最适使用量计算值为 4 ng,实际反应体系内使用量应为插入片段扩增产物最少使用量 20 ng。
 线性化克隆载体和插入片段扩增产物不进行DNA纯化直接使用时,加入总体积应不超过反应体系体积的1/5,即4 μl。
 试剂盒中提供500 bp control insert (25 ng/μl) 和pUC19control vector, linearized (50 ng/μl) 各5 μl,需要时可进行阳性对照反应,每次反应各加1 μl。
3.2 重组反应
1)体系配制完成后,用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分,避免产生气泡 (请勿剧烈震荡或者涡旋混匀) 。
2)置于50反应15 min。
【注】:当插入片段>5kb时,可将孵育温度延长至20min。
3)待反应完成后,立即将反应管置于冰水浴中冷却5 min。
4)反应产物可直接进行转化;也可储存于-20,待需要时解冻转化。
【注】:我们推荐您在PCR仪或者水浴锅等温控比较精确的仪器上进行反应。
4. 重组产物转化、涂板
1)取5 μl冷却反应液,加入到100 μl感受态细胞中,轻弹管壁数下混匀,在冰上放置30 min。
2)42热激45~90秒,冰水浴孵育2 min。
3)加入900 μl SOC或LB培养基,37孵育10 min充分复苏。37摇菌45 min。
4)取100 μl菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将平板倒置,于37过夜培养。
【注】:我们推荐您使用转化效率>10cfu/μg的感受态细胞。如果感受态转化效率<108 cfu/μg(例如用CaCl2法新鲜制备的感受态转化效率通常在106-107 cfu/μg之间) ,请将培养菌液在5000 rpm离心3 min收集菌体,用100 μl LB培养基重悬后全部涂板。
5. 克隆鉴定
最方便快捷的方法是菌落PCR。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至20~50 μl LB 培养基中混匀,直接取1 μl作为PCR模板。
我们推荐您至少用一条通用测序引物进行菌落PCR,这样可以避免PCR假阳性的产生。
将PCR阳性菌落的剩余菌液接种至含有适当抗生素的LB培养基中培养过夜,提取质粒做后续的鉴定。
 


附录
 
线性化克隆载体和插入片段扩增产物浓度测定
将线性化克隆载体和插入片段扩增产物做数个等体积稀释梯度,原始产物和稀释后产物各取1 μl进行琼脂糖电泳,与DNA分子量标准 (DNA Marker)比较条带亮度以确定其近似浓度(绝大多数DNA分子量标准都有确定的DNA浓度)。由图可知,pUC19酶切产物DNA浓度约为100 ng/μl;扩增产物DNA浓度约为400 ng/μl。
 
 
MDNA Marker III。上样5 μl,除1.2 kb条带为100 ng以外,其余条带DNA量均为50 ng。可见,pUC19酶切产物稀释一倍后上样1 μl,条带亮度与相近大小Marker条带3.0 kb亮度相似 (图中橙色框标记)因此pUC19酶切产物DNA浓度约为 50 ng × 2 =100 ng/μl扩增产物稀释七倍后上样1 μl,条带亮度与相近大小Marker条带0.5 kb亮度相似 (图中绿色框标记)因此扩增产物DNA浓度约为50 ng × 8 = 400 ng/μl