北京厚生博泰科技有限公司
pUC-T Simple连接试剂盒
pUC-T Simple Ligation Kit
(目录号HS0507)
产品包装
试剂盒成分 | 20次 |
pUC-T Simple（50 ng/ul） | 20 ul |
T4 DNA Ligase (3U/ul) | 20 ul |
10 × Ligation Buffer | 30 ul |
2 × Ligation Buffer | 100 ul |
Control Insert（50 ng/ul） | 10 ul |
ddH2O | 1 ml |
自备试剂
克隆实验需自备感受态细胞、IPTG、X-Gal和二甲基甲酰胺
保存条件
-20℃保存，避免反复冻融。
产品简介
本产品由pUC18载体改造而成，在pUC18载体的多克隆位点中引入EcoR V酶切位点，用EcoR V限制性内切酶进行酶切反应后，在两侧的3 端添加 T，同时消除了载体上的多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。此时如果使用PCR扩增引物导入的酶切位点进行DNA酶切时，酶切反应将不会受到T载体上其它多克隆酶切位点的影响，可以大大提高酶切效率，增加亚克隆成功率。该载体尽管消除了LacZ基因上的多克隆酶切位点，但不影响β-半乳糖苷酶的正常表达，因此，PCR产物克隆后仍可以利用α-互补性进行蓝白斑筛选。
本试剂盒提供了两种连接Buffer： 10 × Ligation Buffer适合置于 16℃连接过夜，可获得最佳连接效果；2×Ligation Buffer为快速连接Buffer，25℃连接10 分钟即可转化，快捷方便。带有插入片段的重组子可根据α互补原理，进行蓝白斑筛选，判断载体中有无外源基因的插入。克隆后可以用 BcaBEST Sequencing Primers 和 M13 通用引物对 PCR产物进行测序。
产品特点
1. 在pUC18载体基础上构建而成，具有pUC18载体的相似功能。
2. 克隆效率高，阳性率在90%以上，缩短了筛选过程。
操作步骤
1. 将载体在冰上融化（尽可能避免反复冻融载体，在初次使用时最好分装成小份，每次使用时取出一小份），短暂离心，以免液体挂在管壁上。
2. 按以下体系配制反应液
成 分 | 2 × Ligation Buffer | 10 × Ligation Buffer |
反应体系 | 对照体系 | 反应体系 | 对照体系 |
pUC-T Simple Vector | 1 ul | 1 ul | 1 ul | 1 ul |
目的PCR片段 | X ul | 0 | X ul | 0 |
Control insert | 0 | 1 ul | 0 | 1 ul |
2 × Ligation Buffer | 5 ul | 5 ul | 0 | 0 |
10 × Ligation Buffer | 0 | 0 | 1 ul | 1 ul |
T4 DNA ligase | 1 ul | 1 ul | 1 ul | 1 ul |
ddH2O | 补足到10 ul | 补足到10 ul | 补足到10 ul | 补足到10 ul |
（注意：本试剂盒提供两种连接缓冲液，切不可将两者加入到同一离心管中；载体与PCR片段的摩尔比控制在1：3 ~ 1：8范围内）
3. 轻弹离心管以混匀内容物，短暂离心，如选择10 × Ligation Buffer请将混合物置于22 ~ 26℃水浴反应1 ~ 2 h或16℃过夜。如选择2 × Ligation Buffer请将混合物置于22 ~ 26℃水浴反应5 ~ 10 min（反应时间不要超过15 min，否则会降低连接效率），反应结束后将离心管置于冰上。
（注意：我们推荐使用10 × Ligation Buffer，16℃过夜连接）
4. 将连接产物（10 ul）加入至 100 ul 感受态细胞中，冰浴30 min。
（注意：为节约成本，100 ul 感受态细胞可分成2等份使用，连接产物加5 ul 即可）
5. 42℃热击90 sec，置于冰上孵育2 ~ 3 min。
6. 加入900 ul SOC或LB液体培养基（不含抗生素），37℃振荡培养45 min。
7. 取100 ~ 200 ul混合液在含有 X-Gal、IPTG和Amp的LB固体培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。
8. 挑选白色菌落，使用PCR法或酶切法鉴定插入片段是否正确。
注意事项
1. Insert DNA 要求
1) 连接使用的PCR 片段3’末端应带有“A”尾。有些高保真DNA 聚合酶，如Pfu 扩增的 PCR 产物是平滑末端，可使用加A 试剂盒加上A 尾后，再进行T 载体克隆。
2) PCR 产物建议进行切胶回收纯化后再进行T 载体克隆，以免PCR 产物中的非特异片段或残存引物等杂质影响。
2. 感受态要求
建议使用高效的热击转化感受态细胞，这样才可能得到比较理想的阳性克隆，如需进行蓝白筛选，宿主细胞必须具有正确的基因型（F´编码的【lacZ ΔM15】）产生ω片段，才可能与载体DNA 产生的LacZ α多肽相结合，表现出β-半乳糖苷酶活性（α互补）。
3. 阳性克隆筛选
阳性DNA 片段成功插入至pUC-T Vector 中后，一般情况下β-半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp 的LB 固体培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA 片段插入载体时，基因的读码框有可能正好与LacZ 的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。
4. 阳性对照
为了确认实验操作的正确性以及实验试剂的有效性，我们建议使用Control Insert (700 bp) 进行阳性对照实验。
----------------------------------------------------------------------------- 免费领取试用装，联系人：张道军，
电话：18010069130