pUC-T克隆试剂盒

pUC-T Cloning Kit

（目录号HS0506）

 

目录号	包装	价格
HS0506-1	20次	500元
HS0506-2	60次	1300元

产品包装

试剂盒成分	20次
pUC-T（50 ng/ul）	20 ul
T4 DNA Ligase (3U/ul)	20 ul
10 × Ligation Buffer	30 ul
2 × Ligation Buffer	100 ul
Control Insert（50 ng/ul）	10 ul
TOP10 Competent cell	10 × 100 μl
pUC19 (0.1 ng/ul)	10 ul
ddH2O	1 ml

自备试剂

克隆实验需自备IPTG、X-Gal和二甲基甲酰胺

保存条件

TOP10 Competent cell 于-70℃保存，其余试剂-20℃保存。

产品简介

TA克隆是利用T载体3末端带有一个突出的T碱基， 而PCR扩增产物3端带有一个突出的A碱基的特点，在DNA连接酶的作用下，将PCR扩增产物克隆到T载体上，该方法是克隆PCR扩增产物的主要手段，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。本产品由pUC18载体改造而成，在pUC18载体的多克隆位点Xba I和Sal I位点之间插入EcoR V酶切位点，用EcoR V限制性内切酶进行酶切反应后，在两侧的3端添加 “T” 而成。专门用于TA克隆。

本试剂盒提供了两种连接Buffer： 10 × Ligation Buffer适合置于 16℃连接过夜，可获得最佳连接效果；2 × Ligation Buffer为快速连接Buffer，25℃连接10 分钟即可转化，快捷方便。带有插入片段的重组子可根据α互补原理，进行蓝白斑筛选，判断载体中有无外源基因的插入。克隆后可以用 BcaBEST  Sequencing Primers 和 M13 通用引物对 PCR产物进行测序。另外，本试剂盒还提供高效的感受态细胞TOP10，可实现PCR产物的快速连接、转化一站式服务。

产品特点

1.       在pUC18载体基础上构建而成，具有pUC18载体的相似功能。

2.       克隆效率高，阳性率在90%以上，缩短了筛选过程。

操作步骤

1. 将载体在冰上融化（尽可能避免反复冻融载体，在初次使用时最好分装成小份，每次使用时取出一小份），短暂离心，以免液体挂在管壁上。

2. 按以下体系配制反应液

成  分	2 × Ligation Buffer		10 × Ligation Buffer
	反应体系	对照体系	反应体系	对照体系
pUC-T Vector	1 ul	1 ul	1 ul	1 ul
目的PCR片段	X ul	0	X ul	0
Control insert	0	1 ul	0	1 ul
2 × Ligation Buffer	5 ul	5 ul	0	0
10 × Ligation Buffer	0	0	1 ul	1 ul
T4 DNA ligase	1 ul	1 ul	1 ul	1 ul
ddH2O	补足到10 ul	补足到10 ul	补足到10 ul	补足到10 ul

（注意：本试剂盒提供两种连接缓冲液，切不可将两者加入到同一离心管中；载体与PCR片段的摩尔比控制在1：3 ~ 1：8范围内）

3. 轻弹离心管以混匀内容物，短暂离心，如选择10 × Ligation Buffer请将混合物置于22 ~ 26℃水浴反应1 ~ 2 h或16℃过夜。如选择2 × Ligation Buffer请将混合物置于22 ~ 26℃水浴反应5 ~ 10 min（反应时间不要超过15 min，否则会降低连接效率），反应结束后将离心管置于冰上。

（注意：我们推荐使用10 × Ligation Buffer，16℃过夜连接）

4. 将连接产物（10 ul）加入至 100 ul 感受态细胞中，冰浴30 min。

（注意：为节约成本，100 ul 感受态细胞可分成2等份使用，连接产物加5 ul 即可）

5. 42℃热击90 sec，置于冰上孵育2 ~ 3 min。

6. 加入900 ul SOC或LB液体培养基（不含抗生素），37℃振荡培养45 min。

7. 取100 ~ 200 ul混合液在含有 X-Gal、IPTG和Amp的LB固体培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。

8. 挑选白色菌落，使用PCR法或酶切法鉴定插入片段是否正确。

 

注意事项

1. Insert DNA 要求

1) 连接使用的PCR 片段3’末端应带有“A”尾。有些高保真DNA 聚合酶，如Pfu 扩增的 PCR 产物是平滑末端，可使用加A 试剂盒加上A 尾后，再进行T 载体克隆。

2) PCR 产物建议进行切胶回收纯化后再进行T 载体克隆，以免PCR 产物中的非特异片段或残存引物等杂质影响。

2. 感受态要求

建议使用高效的热击转化感受态细胞，这样才可能得到比较理想的阳性克隆，如需进行蓝白筛选，宿主细胞必须具有正确的基因型（F´编码的【lacZ ΔM15】）产生ω片段，才可能与载体DNA 产生的LacZ α多肽相结合，表现出β-半乳糖苷酶活性（α互补）。

3. 阳性克隆筛选

阳性DNA 片段成功插入至pUC-T Vector 中后，一般情况下β-半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp 的LB 固体培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA 片段插入载体时，基因的读码框有可能正好与LacZ 的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。

4. 阳性对照

为了确认实验操作的正确性以及实验试剂的有效性，我们建议使用Control Insert (700 bp) 进行阳性对照实验。    免费领取试用装，

联系人：张道军，

电话：18010069130