介 绍
本品系由自动化核酸提取系统提取乙型肝炎病毒， 采用 核酸扩增（ PCR ）技术结合荧光杂交探针技术 及竞争性内标技术，对人血清和血浆中乙型肝炎病毒核酸（ DNA ）的定量检测。可用于临床对乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物的疗效观察。
在HBV荧光定量PCR检测体系中，导入竞争性内标法和磁珠法提取检测HBV病毒 DNA 。在体系中加入竞争性内标的优点在于在相同的引物条件下可直接排除假阴性的结果
特 点
• 采用亚微米磁珠法进行乙肝病毒提取，能够在我公司研制的自动化核酸提取仪上进行，保证了同批次质控品和样本乙肝病毒拷贝数提取的一致性，对于根据质控品进行数量判断的定光定量 PCR 系统，大大增加了检测的准确性。
• 本试剂盒是基于我公司生产的荧光定量 PCR 检测系统开发的。相对于我国目前开发的试剂盒均是在国外的仪器上开发的情况，我公司将向我国的医院用户提供仪器和试剂盒配套的系统化解决方案，而不是基于国外的仪器平台，提高了仪器和试剂盒的配合度，结果更准确，稳定性更佳。
• 由于采用了MGB探针技术，加大了荧光分辨率，探针的稳定性大大提高，使检测的分辨率提高。
• 在 HBV 荧光定量 PCR 检测体系中，导入竞争性内标法可直接排除假阴性的结果。
• 磁珠提取方法还可对传统的提取方法不能处理的如抗凝血剂处理的血液样本、溶血样本进行 DNA 提取并进行 PCR 检测。加大了试剂盒的适用范围。
• 体系中加入 dUTP/UDG 去污染系统。
操作流程示意图
实验数据
一、灵敏度实验
将同一标准品直接分三次进行稀释，检测出最小拷贝数数据如下：
定量 PCR 结果图如下：
统计分析如下：
标本名称 | 浓度值（ IU/ml ） | 平均浓度值（ IU/ml ） | CT 值 | 平均 CT 值 |
2-1 | 3.00E+02 | 4.55E+02 | 36.16 | 35.61 |
3-1 | 5.65E+02 | 35.24 | ||
4-1 | 5.01E+02 | 35.42 | ||
2-2 | 4.46E+03 | 6.64E+03 | 32.25 | 31.72 |
3-2 | 8.52E+03 | 31.31 | ||
4-2 | 6.93E+03 | 31.61 | ||
2-3 | 3.23E+04 | 4.24E+04 | 29.39 | 29.05 |
3-3 | 6.08E+04 | 28.47 | ||
4-3 | 3.42E+04 | 29.30 | ||
2-4 | 2.90E+05 | 4.90E+05 | 26.21 | 25.56 |
3-4 | 7.50E+05 | 24.83 | ||
4-4 | 4.30E+05 | 25.64 | ||
2-5 | 2.58E+06 | 4.73E+06 | 23.04 | 22.29 |
3-5 | 7.26E+06 | 21.55 | ||
4-5 | 4.35E+06 | 22.29 | ||
2-6 | 3.35E+07 | 4.82E+07 | 19.33 | 18.86 |
3-6 | 6.59E+07 | 18.35 | ||
4-6 | 4.52E+07 | 18.90 | ||
2-7 | 3.25E+08 | 1.96E+08 | 16.04 | 16.94 |
3-7 | 1.64E+08 | 17.03 | ||
4-7 | 1.00E+08 | 17.74 |
上述表格数据表明，直接稀释的最小检测拷贝数为 4.55E+02IU/ml （平均值）时，检测值稳定性较好，并且线性范围达到了 10 2 ～ 10 8 IU/ml 。
二 、 精密度实验
方法： 将10份含不同病原体量的临床标本或模拟标本（包括强阳性、临界阳性及低于临界值的标本）和试剂盒内3份对照品一起分送3个实验室，在3个不同日期对每份标本作3次重复测定，然后进行结果统计。
经统计学计算结果如下：
标本名称 | -1 | -2 | -3 | +/-1 | +/-2 | +/-3 | +/-4 | +1 | +2 | +3 |
对数平均值 | - | - | - | 3.68 | 4.58 | 4.29 | 4.36 | 6.37 | 5.80 | 5.91 |
对数标准差 | - | - | - | 0.18 | 0.07 | 0.09 | 0.12 | 0.35 | 0.29 | 0.22 |
CV ％ | - | - | - | 4.84 | 1.58 | 2.08 | 2.85 | 5.49 | 5.05 | 3.70 |
从三个实验室结果得出精密度结果，平均标准差为 0.19 ，最大对数标准差为 0.35 ，平均 CV 值为 3.66 ％，最大 CV 值为 5.49 ％。
本实验小结：标准差和 CV 值较小，表明精密度较好。
三、中国药品生物制品检定所考评
L0~L5为HBV DNA定量线性灵敏度参考品（L0~L5）分别为1×10 8～1×10 3（ IU/ml）。
结果统计：试验有效性判断：试验有效，r＝-1.000≤0.970。
线性灵敏度（ L0~L5 ）检测结果：
① IU 数（ IU/ml ）：
线性灵敏度参考品 7 份 | 质量标准 （ IU/ml ） | 检测结果 （ IU/ml ） |
L5 | 1.51 × 10 3 ~1.23 × 10 4 | 5.58E+03 |
L4 | 1.82 × 10 4 ~1.48 × 10 5 | 1.31E+05 |
L3 | 1.66 × 10 5 ~1.32 × 10 6 | 4.09E+05 |
L2 | 1.59 × 10 6 ~1.26 × 10 7 | 4.76E+06 |
L1 | 1.48 × 10 7 ~1.18 × 10 8 | 2.53E+07 |
L0 | 7.76 × 10 7 ~6.17 × 10 8 | 1.90E+08 |
②r值的计算：以理论值与测定值的双对数作回归分析计算r值
| L5 | L4 | L3 | L2 | L1 | L0 |
理论值 | 3.636 | 4.715 | 5.672 | 6.649 | 7.619 | 8.343 |
测定值 | 3.747 | 5.117 | 5.612 | 6.678 | 7.403 | 8.279 |
r ＝ 1.00
四、三家省级以上三甲医院考评结果
医院名称 | 病例数 | 符合率（ % ） | 相关系数 | 配对 T 检验 |
1# | 397 | 97.98 | r=0.975(P=0.001) | t=0.337,v=396,P=0.736( 双侧 ) ， P ＞ 0.05 |
2# | 369 | 98.92 | r=0.988(P=0.001) | t=-1.735,v=368,P=0.084( 双侧 ) ， P ＞ 0.05 |
3# | 341 | 98.5 | r=0.993(P=0.001) | t=-0.553,v=340,P=0.581( 双侧 ) ， P ＞ 0.05 |
• 符合率结果表明本试剂 符合率较好，具有较强的临床适用性，符合预期考核结果。
• 相关系数和配对 T 检验结果表明 ，本试剂与对比试剂定量检测浓度值无显著差异。
• 综上表明考核试剂定量结果与对比试剂有很好的一致性及符合率。
参考文献 References
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