产品描述

Hieff^TM qPCR SYBR^® Green Master Mix(High Rox Plus)是2×实时定量PCR扩增的预混合溶液。Mix中含有热启动Hieff^TM DNA Polymerase、SYBR^® Green I、dNTPs、Mg²⁺及High Rox。使用时，仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR，大大简化操作过程，降低污染几率。

本品采用的DNA聚合酶配体可以随温度变化实时调节DNA聚合酶活性。配方添加了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。

适用机型

Applied Biosystems: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT FAST, StepOne^TM, StepOne Plus^TM.

反应体系（推荐冰上配制）

【注】： 使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

a) 引物浓度：通常引物终浓度为0.2μM，也可以根据情况在0.1-1.0μM之间进行调整。

b) 模板浓度：1µg RNA的反转录产物需要稀释10倍左右，以减轻RNA对PCR扩增的抑制。

c) 反应体系：推荐使用20μl或50μl，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

d) 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

扩增程序  （本产品可适用三步法和两步法程序）

三步法程序

两步法程序

【注】：

a) 预变性时间：根据不同模板和引物的具体情况可适当缩短至2min。

b) 退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。

c) 荧光信号采集：请参考仪器设置。

d) 熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。

结果分析

定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。

1) 扩增曲线：标准扩增曲线为S型。

Ct值落在20-30之间时，定量分析最准确；

Ct值小于10，需要将稀释模板后，重新进行实验；

Ct值介于30-35之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；

Ct值大于35时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。

2) 熔解曲线：

熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。

熔解曲线出现双峰，需要通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。

如果是引物二聚体，建议降低引物浓度，或者重新设计扩增效率高的引物。

如果是非特异性扩增，请提高退火温度，或者重新设计更高特异性的引物。

引物设计指南

1. 推荐引物长度25bp左右。扩增产物长度150bp为佳，可以在100bp-300bp内选择。

2. 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃-65℃为佳。

3. 引物碱基分布要均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。

4. 引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。

5. 引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。

6. 设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

注意事项

1. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒（货号：11104），以有效去除RNA样品中残留的基因组。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

运输与保存方式

冰袋运输。-20℃避光储存，有效期1年。

本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料SYBR^® Green I，保存或配制反应体系时需避免强光照射。

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