产品信息

 HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix(Rox Provided Seperately)产品描述

Hieff^TM qPCR SYBR^® Green Master Mix是2×浓缩的实时定量PCR扩增的预混合溶液，专为高特异性、高灵敏度实时定量PCR而设计。Mix中含有热启动的Hieff^TM DNA Polymerase，SYBR^® Green I，dNTP Mix，Mg²⁺。使用时仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR，大大简化操作过程，缩短操作时间，降低污染。能有效抑制非特异性的PCR扩增，从而显著提高PCR反应的扩增效率，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。

本产品针对不同厂商的实时荧光定量PCR仪，分别提供不同浓度的Rox参比液（High Rox/Low Rox），用于校正孔与孔之间的荧光信号误差。

 HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix(Rox Provided Seperately)产品组分

【*】: 本产品特提供ROX用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，请根据仪器类型选用。

High Rox适用仪器：

Applied Biosystems 5700,7000,7300,7700,7900,7900HT, 7900HT Fast, ABI StepOne^TM, StepOne Plus^TM

Low Rox适用仪器：

Applied Biosystems7500, 7500 Fast,ViiA^TM7, Stratagene MX3000P^TM, MX3005P^TM, MX4000^TM,

QuantStudio™ Dx, QuantStudio™ 6 Flex, QuantStudio™ 7 Flex

下列仪器不需要Rox进行校正：

Bio-Rad CFX96^TM, CFX 384^TM, iCycler iQ^TM, iQ^TM5, MyiQ^TM, MiniOpticon^TM, Opticon®, Opticon 2, Chromo4^TM;

Cepheid SmartCycler®;

Eppendorf Mastercycler® ep realplex，realplex 2 s;

Illumina Eco qPCR;

Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000; Qiagen Corbett;

Roche Applied Science LightCycler^TM 480, LightCycler 2.0; Lightcycler^®96

Thermo Scientific PikoReal Cycler

 HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix(Rox Provided Seperately)运输与保存方式

冰袋运输，-20℃避光储存，有效期1年。                                              

尽量避免反复冻融，如每次使用量较少，推荐小份分装使用。

操作流程

【注】：由于本品检测灵敏度极高，即使空气中微量的DNA气溶胶都可以引起污染，进而导致实验失败。因此反应体系配制时请于超净工作台内进行，配制过程中请使用干净灭菌枪头、反应管，条件容许的实验室推荐使用专用的移液枪，避免交叉污染。推荐使用带滤芯的枪头。

1．上下颠倒混匀Mix，避免剧烈震荡以免产生过多气泡。Mix轻微离心后即可使用。

2．qPCR反应体系配制^*

【*】：反应体系中各成分的用量可根据以下原则自行调整，

a）此处根据仪器类型，不添加或添加相应量的50×high Rox或者50×low Rox。

b）反应体系中引物浓度一般在0.1-1.0 μM之间，一般引物终浓度为0.2 μM扩增效果较好；

c）cDNA模板的体积不要超过反应体积的1/10；

d）扩增产物长度请选择在100 bp-500 bp范围内，尤其推荐100 bp-150 bp之间；

e）qPCR灵敏度极高，建立反应体系时加入模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响。 因此如仪器允许，推荐您使用50 μl反应体系，并且将模板稀释后（如稀释至5μl/样本）加入反应体系中，这样可以有效提高实验的重复性。

3．PCR 反应条件

推荐两步法程序进行实验，即退火/延伸设置在60℃。也可以用三步法进行PCR扩增反应。

【注】：Hieff^TM DNA Polymerase需要热激活处理以恢复酶活性，请至少设置PCR反应预变性条件为95℃ 5min。如果模板中GC含量较高，可将预变性时间延长至10min。

【注】：a: 延伸时间需要根据定量PCR仪所需要的数据采集最短时间限制自行调整。使用ABI 7700和7900HT时至少30s；使用ABI 7000和7300时至少31s；使用ABI 7500时至少34s；使用ABI StepOne Plus^TM 时至少10s。

b: 融解曲线采集程序可根据您使用的Real Time PCR仪自行调整，通常情况下使用仪器默认程序即可。

4．反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线及融解曲线，进行标准曲线制作等。也可用琼脂糖凝胶电泳确认PCR扩增产物特异与否。

1）对荧光定量而言，Ct值落在20-28之间定量最为准确。如果Ct值太小，请稀释模板后重新进行试验；Ct值大于35时，       Real Time PCR检测无效，目标基因无表达；当Ct值介于32-35之间时，需要至少三个重复才能判断目标基因是否表达。

2）如果反应特异性好，无非特异性扩增产物产生，无引物高级结构，则融解曲线应该是单峰曲线，此时定量结果有效；若融解曲线出现显著多峰，则定量结果无效，请优化条件重新进行定量实验。（引物设计不合理而导致的引物二聚体在融解曲线内峰值一般位于75℃左右，如该峰显著请更换引物再次实验）。

3）使用本品进行绝对定量需自行绘制标准曲线；进行相对定量可根据下述公式计算目标基因表达情况：

设定Ct^A1为1号样本目标基因Ct值，Ct^B1为1号样本内参基因Ct值；Ct^A2为2号样本目标基因Ct值，Ct^B2为2号样本内参基因Ct值，则1号样本和2号样本目标基因表达水平比值可粗略计算为（2^-△△Ct法）：

△△Ct =（Ct^A2-Ct^B2）-（Ct^A1-Ct^B1）= X，则2号样本内目标基因的表达水平为1号样本内的2 ^-X 倍。