Caspase 9 活性检测试剂盒(Caspase 9 Activity Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中Caspase 9酶活性或纯化的Caspase 9酶活性的试剂盒。

Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。线粒体释放细胞色素c以后，caspase 9可以和细胞色素c以及Apaf1形成复合物，同时被激活。激活的caspase 9可以激活细胞凋亡的最关键酶caspase 3，从而促进后续的细胞凋亡信号。Caspase 9的激活可以通过***酸化进行调控。本Caspase 9 活性检测试剂盒是基于casepase 9可以催化底物Ac-LEHD-pNA产生黄色的pNA，pNA在405nm附近有强吸收，从而可以通过测定吸光度来检测caspase 9 的活性。

本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过100μl的分光光度检测杯检测，可用于培养细胞或新鲜组织样本的caspase-9检测。

 

使用方法：

一、裂解缓冲液和检测缓冲液配制

根据待测样品数准备裂解缓冲液和检测缓冲液，每1ml缓冲液中加入10ul DTT。

 

二、样品处理

A．细胞样品

1.       收集2-5×10⁶个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。

2.       用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。

3.       在细胞中加入100μl冷的裂解缓冲液，高速涡旋振荡15秒。

4.       置冰上15分钟，每隔5分钟高速涡旋振荡15秒。

5.       在4℃，500×g条件下离心5分钟。

6.       快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上或-80℃冰箱保存备用。

 

B． 组织样品

1. 取适量组织样本剪碎，按照50mg/100μl冷的裂解缓冲液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体（或用液氮研磨），冰上静置15分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。

1.       在4℃，500×g条件下离心5分钟。

2.       快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上或-80℃冰箱保存备用。

 

三、对上述处理过的上清用Bradford法进行蛋白定量。

 

四、Caspase 9活性检测

1、  取10ul大约含20-50ug蛋白的裂解上清，加入90ul检测缓冲液。

2、  再加入10ul Ac-LEHD-pNA ，在37℃下避光反应1-2小时，有黄色颜色产生即可进行检测，如果颜色变化不明显，时间可以延长，甚至孵育过夜。

3、  测定A405nm或A400nm。

4、 根据凋亡诱导的细胞的吸光值与空白对照细胞的吸光值的比值计算相对的Caspase-9活性程度。