定点突变试剂盒可以在克隆于质粒DNA序列的特定位点诱导突变。理论上可以保证突变率达到100%。整个实验过程简单快捷只需要两个步骤。试剂盒不需要用到M13载体和甲基化步骤。该试剂盒可以诱导某个已知基因的特定碱基进行定点突变、再突变成野生型、密码子突变、插入或者缺失等，因此可以用于功能基因组学和蛋白质组学的研究。另外由于试剂盒能够诱导特异基因突变，又可以应用于蛋白质工程学研究领域。定点突变试剂盒操作十分简单（根据我们提供的引物设计原则设计引物；用Muta-direct™酶进行15~18个循环的PCR扩增反应；Mutazyme™酶处理选择突变克隆；转化）。理论上在LB平板上的克隆100%是突变克隆，通过对突变克隆的测序分析，正确的突变可以应用于后续实验。

 

●操作简便，无需特殊的实验技能

●2~3天即可完成基因的定点突变

●整个实验过程只需要用到两种酶：Muta-direct™酶和Mutazyme™酶

  ●广泛的使用范围：可以用于点突变（Point mutation），缺失突变（Deletion）和插入突变（Insertion）等。

  ●100%的突变效率

 

请将试剂盒中提供的各种试剂于-20℃贮存。由于试剂盒中提供的反应缓冲液及dNTP是为反应专门优化的，所以不要用其它的反应缓冲液及dNTP代替。

 

试剂盒提供的对照模板及引物，可以完成5次对照实验。包括对照反应在内，本试剂盒共可进行15次基因定点突变反应（每次反应体系50μl）。

组成                                                                      次量

Muta -Direct™Enzyme (2.5U/μl)                             15μl

Muta-Direct™Reaction Buffer (10×)                       100μl

dNTP Mixture                                                               30μl

Mutazyme™Enzyme (10U/μl)                                   15μl

pUC18 Control Plasmid (10ng/μl)                          10μl

Control Primer Mix (20pmol/µl)                                 15µl

Competent cells                                                           Not provided

定点突变对照实验

试剂盒中提供的对照质粒为pUC18，通过它可以判断实验的成功与否。pUC18质粒包含lac Z基因，用试剂盒中提供的对照引物可以诱导pUC18中丝氨酸（TCG）突变为终止密码子（TAG），这样会导致lacZ基因失活，因此LB平板上的克隆必须都为白色才证明突变成功。对于首次做突变实验的用户，可以通过对照反应观察实验是否成功。

引物设计

首先需要进行引物设计，设计时请参考如下原则。

通常引物长度为25~45mer，我们建议引物长度为30~35mer。

注：突变位点应该设计在引物的中央位置。

如果设定的引物长度为30mer，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。

如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。