本试剂盒是采用核酸扩增技术结合SYBR Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂，可以快速正确地对目的基因进行检测、定量。 

本试剂盒提供2×SYBR Green Mix，使用时只需加入引物、模板即可进行Real Time PCR反应，操作非常快捷简单；本试剂盒通过反应液组份的改良和更高品质酶的应用，使该试剂盒具有扩增效率高、特异性强、重复性好、灵敏度高等优点，对高GC序列的反应性和定量性也大大提高。

使用方法

1  取出2×SYBR Green Mix上下轻缓颠倒混匀，在配制前可进行短暂离心，使用混匀器混匀时转速小于1400。

2  PCR反应液配制组份：（反应液配制时请在冰上进行）

 

试剂组份	体积（ul）	终浓度
2×SYBR Green Mix①	25	1×
PCR Forward Primer （10uM）	1	0.2uM
PCR Reverse Primer （10uM）	1	0.2uM
Templete DNA（<50ng）②	5	--
ddH2O	18	--
Total③	50	--

 

① 2×SYBR Green Mix内含PCR buffer、 Mg2+ 、dNTP mixture、SYBR Green I、Taq酶等。 

② 因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释确定最佳的DNA模板量。 

③ 建议反应液体积为50 ul。

3 充分混匀反应液，按45ul分装至各个PCR反应管中。在每个PCR反应管中，各加入5ul模板。加入模板的体积可作适当调整，但不应超过10ul。 

4 将加好模板的PCR反应管混匀后进行短暂离心，以确保所有试剂流到PCR管底部。 

 

 

5  PCR 反应 

Real Time PCR 反应程序设置如下： 

         95℃，1min； 

         94℃，15s

         60℃，15s      40cycles

         72℃，30s

         荧光信号采集设在 72℃(每循环第三步反应时)；

   注：退火温度可以根据引物的退火温度来调整。

    融解度曲线程序设置如下：

         95℃，1min；

         65℃，1min；

         95℃，20s，步进 0.5℃/s，；

         30℃，1min。

 

结果分析与判定

1  将标准品或参照物的浓度输入，选择样点拟合法进行分析，基线（零点调整）根据扩增曲线实际情况选取一段相对平稳（无异常波动）的拐点之前的荧光信号作为基线调整，噪声容限以基线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，然后进行定量分析。也可根据仪器噪音情况另行调整。 

2  分析后记录未知样品的浓度或 Ct 值。 

3  融解曲线分析有自动分析和手动分析两种，根据需要进行选择。分析后记录   

Tm值。 

4  也可以选择利用琼脂糖凝胶电泳检查分析 PCR 产物的特异性。 

 

注意事项

1  在实验前，请详细阅读说明书。 

2  本试剂盒仅供科研使用。 

3  本试剂中含有荧光染料，保存试剂或配制 PCR 反应液时请避光放置。 

4  核酸扩增时容易污染，导致结果不可靠。故要求在进行扩增实验时，严格按照标准 PCR 流程进行。

 

5  试剂盒须在-20℃避光长期保存，避免反复冻融5次以上，否则可能导致试剂性能下降。如果试剂盒在2周内使用完，可在2-8℃避光保存。