玉米素 Sigma
英文名称: Zeatin
型号:null    产品货号: Z0164
价格:请致电:010-57128832,18610462672
品牌: 美国
试剂级别: 分子生物学级

Zeatin玉米素 SigmaZ0164 5mg

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Zeatin 玉米素 Sigma 5mg
Xanthione 黄嘌呤 Sigma 1g
Xylene Cyanol FF 二甲***青 Sigma 1g
Sodium Chloride 氯化钠 Amresco 100g
Xanthione oxidase 黄嘌呤氧化酶 Sigma 5u
L-Valine L- 缬氨酸 上海 10g
UMP Na2 5-单***酸鸟苷二钠 Sigma 100mg
Urea 尿素 Sigma 100g
Urea 尿素 Sigma 500g
Thymidine 胸腺嘧***核苷  Sigma 1g
Trypan Blue 台盼蓝 Sigma 5g
2-Thiobarbituric acid 硫代***酸 Sigma 5g
Thrombin 凝血酶 Sigma 1000u
Transferrin 转铁蛋白 Sigma 10mg
Thymine 胸腺嘧*** Sigma 5g
L-Tryptophan L-色氨酸 上海 5g
Spectinomycin 盐酸壮观霉素 Sigma 1g
Succinic acid 琥珀酸 sigma 25g
Succinic acid Sidium 琥珀酸钠 sigma 25g
Safranin O 番红O Sigma 5g

imes;HieffTM I Reaction Buffer

100 μl

100 μl×5

11101-B

HieffTM I Reverse Transcriptase (200 U/μl)

10 μl

50 μl

活性定义

Poly(rA) Oligo(dT)为模板/引物,在3710分钟内,掺入1 nmoldTTP为酸不性溶物质所需要酶量定义为1个活性单位(U)。

 第一代耐热逆转录酶运输与保存方法

冰袋(wet ice)运输。收到产品后放到-20 ºC保存。

质量控制

核酸外切酶残留检测:200 U本品和0.6 μg λ-Hind 37 ºC下孵育1小时,DNA的电泳谱带不发生变化。

核酸内切酶残留检测:200 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA37 ºC下孵育1小时DNA的电泳谱带不发生变化。

RNase残留检测:200 U本品1 μg小鼠肝脏总RNA37 ºC下孵育1小时,RNA电泳谱带不发生变化。

功能检测1逆转录体系中加入200 U本品,以500 ng Hela cell total RNA为模板,Oligo(dT)18为引物,50 ºC反应45分钟。取10% cDNA产物进行PCR扩增DNCH基因。琼脂糖凝胶电泳,EB染色,可见有单一的5.6 kb条带。

功能检测2逆转录体系中加入200 U本品,以100 pg Hela cell total RNA为模板,Oligo(dT)18为引物,50 ºC反应30分钟。取10% cDNA产物进行PCR扩增β-actin基因。琼脂糖凝胶电泳,EB染色,可见有单一的550 bp条带。        

 第一代耐热逆转录酶注意事项

1)请保持实验区域洁净;操作时需穿戴干净的手套、口罩;实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证RNase free,以防止RNase污染。

2)为保证逆转录成功,建议使用高质量的RNA样本。

3)为了您的健康,实验操作时请穿实验服和带一次性手套。

应用实例

1. RNA模板变性

注意RNA模板变性有助于打开二级结构,可在很大程度上提高第一链cDNA的产量。对于长度超过3 kbcDNA片段,请务必进行此步操作。对于GC含量很高(50%以上)建议也进行此步操作。

RNase free离心管中配制如下混合液【表1】,65 加热5 min,迅速置于冰上骤冷,并在冰上静置2 min

模板RNA变性混合体系

RNase free ddH2O

to 13 μl

Oligo(dT)18(0.5 μg/μl)

or Random hexamers(0.1μg/μl)

or Gene Speicific Primers(2 μM)

1 μl

模板RNA

Total RNA:50 ng-5μg;

Poly(A)+ RNA: 5-500 ng

2. 第一链cDNA合成体系

RNase free离心管中配制如下混合液【表2】:

第一链cDNA合成反应体系

上一步的模板RNA变性混合体系

13 μl

5×HieffTM I Reaction Buffer

4 μl

dNTP Mixture(10 mM each)

1 μl

RNase inhibitor (40 U/μl)

1 μl

HieffTM I Reverse Transcriptase(200 U/μl)

1 μl

3. 按照下列条件进行第一链合成反应:

使用Oligo(dT)18

50*

50 min

65**

15 min

[*]:当模板GC含量高(50%以上)或者二级结构复杂,可将逆转录温度提高到55。对于Oligo(dT)18引物,要在55逆转录。需要先在42孵育5min,然后在55孵育50min

[**]65加热15min的目的是失活逆转录酶。

使用Random hexamers

25                

10 min

50*

50 min

65**

15 min

[*]:当模板GC含量高(50%以上)或者二级结构复杂,可将逆转录温度提高到55

[**]65加热15min的目的是失活逆转录酶。

使用Gene Speicific Primers

50*

50 min

65**

15 min

[*]:当模板GC含量高(50%以上)或者二级结构复杂,可将逆转录温度提高到55

[**]65加热15min的目的是失活逆转录酶。

 

得到的第一链cDNA反应产物可立即用于PCR反应,或在-20保存,并在半年内使用;长期存放建议分装后在-80保存。cDNA应避免反复冻融。用于PCR反应的cDNA产物体积建议取PCR反应体积的1/10-1/5