第二代耐热逆转录酶产品描述

Hieff^TM II Reverse Transcriptase（第二代耐热逆转录酶）是Hieff^TM I Reverse Transcriptase（第一代耐热逆转录）的升级产品，是在M-MLV (RNase H^-) Reverse Transcriptase基础上通过体外分子进化技术获得的全新耐热逆转录酶。与上一代相比，Hieff^TM II进一步大幅提高了热稳定性，50℃下半衰期超过240min，并长时间耐受55℃高温且保持稳定，非常适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。此外，Hieff^TM II增加了多个突变位点，进一步增强了模板亲和力和行进性，大幅提升全长cDNA的合成能力，可获得长达20 kb的cDNA。另外，Hieff^TM II对于常见的逆转录抑制物具有更高的耐受度，非常适合于植物组织RNA的逆转录反应。

产品组分

 第二代耐热逆转录酶活性定义

以Poly(rA) Oligo(dT)为模板/引物，在37℃，10min内，掺入1 nmol的dTTP为酸不性溶物质所需要酶量定义为1个活性单位（U）。  

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。收到产品后放到-20 ºC保存。

质量控制

核酸外切酶残留检测：200 U本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在37 ºC下孵育1h，DNA的电泳谱带不发生变化。

核酸内切酶残留检测：200 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在37 ºC下孵育1h，DNA的电泳谱带不发生变化。

RNase残留检测：200 U本品和1 μg小鼠肝脏总RNA在37 ºC下孵育1h，RNA电泳谱带不发生变化。

功能检测1：逆转录体系中加入200 U本品，以100 pg Hela cell total RNA为模板，Oligo(dT)₂₃为引物，50 ºC反应30min。取10% cDNA产物进行PCR扩增β-actin基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的550 bp条带。

功能检测2：逆转录体系中加入200 U本品，以500 ng Hela cell total RNA为模板，Oligo(dT)₂₃为引物，55 ºC反应45min。取10% cDNA产物进行PCR扩增Polε基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的4.8 kb (GC-rich)条带。

功能检测3：逆转录体系中加入200 U本品，以1 pg-1 μg Hela cell total RNA为模板，Oligo(dT)₂₃VN和Random Hexamers为引物，测试qRT-PCR 性能。以6个数量级的模板量的对数值对Ct值做标准曲线，R²>0.990，斜率在-3.20到-3.60之间。

1. 防止RNase污染：

请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证RNase free。

2. 引物选择：

2.1 后续实验为PCR

a, 如果模板为真核生物来源，一般情况下首选Oligo dT₁₈，与真核生物mRNA的3’Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。

b, 基因特异性引物 (GSP)的特异性最高。但有些情况下，用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成。这时，可改用Oligo dT₁₈或Random hexamers重新进行逆转录。

c, Random hexamers特异性最低，所有RNA，包括mRNA, rRNA, tRNA均可以作为Random hexamers的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高，或者模板为原核生物来源，使用Oligo dT₁₈或基因特异性引物 (GSP)无法有效引导cDNA合成时，可使用Random hexamers为引物。

2.2 后续实验为qPCR

a, 将Oligo dT18与Random hexamers混合使用，可使mRNA的各个区域均能以相同效率引发cDNA合成，有助于提高定量结果的重复性。

应用实例

1. 后续实验为PCR

1.1 RNA模板变性

【注意】：RNA模板变性有助于打开二级结构，可在很大程度上提高第一链cDNA的产量。对于长度超过3 kb的cDNA片段，请务必进行此步操作。

在RNase free离心管中配制如下混合液【表1】，65℃ 加热5 min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2 min。

表1 模板RNA变性混合体系

1.2第一链cDNA合成体系

在RNase free离心管中配制如下混合液【表2】：

表2 第一链cDNA合成反应体系

1.3 第一链cDNA合成反应条件【表3】

表3 cDNA合成反应条件

[*]: 仅当使用Random hexamers时需要此步骤；使用Oligo dT₁₈或Gene Specific Primer时省略此步骤。