产品简介：

线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素C 氧化酶，也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责催

化还原型细胞色素C 的氧化，并最终把电子传递给氧，生成水。

还原型细胞色素C 在550nm 有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素C 生成氧化型细胞色

素C，因此550nm 光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。

试验中所需的仪器和试剂：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

产品内容：

试剂一：25 mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：5 mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂三：0.5 mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂四：液体10 mL×2 瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×2 支，-20℃保存；

试剂六：粉剂×2 支，-20℃保存；

工作液的配制：临用前取试剂四、试剂五、试剂六各一支，将试剂五和试剂六依次转移到试剂四中混合

溶解。分批配制工作液是为了防止当天不能测完，导致工作液失败。

操作步骤：

一、线粒体复合体Ⅳ的提取：

(1) 准确称取0.1g 组织或收集500 万细胞，加入1mL 试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

(2) 将匀浆4℃ 600g 离心5min。

(3) 将上清液转移至另一离心管中，4℃ 11000g 离心10min。

(4) 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄露的复合体Ⅳ（此步可选做）。

(5) 在沉淀中加入200uL 试剂二和2uL 试剂三，超生波破碎（功率20%，超声3 秒，间歇10 秒，重复30

次），用于复合体Ⅳ酶活性测定，并且用于蛋白含量的测定。

二、测定步骤：

1. 调零

用蒸馏水于550nm 处调零

2. 样本测定

(1) 取800uL 工作液加入1mL 玻璃比色皿中，在37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）孵育5min。

(2) 取出比色皿，加入40uL 样本，混匀，立即记录550nm 处初始吸光值A1，37℃（哺乳动物）或25℃（其

他物种）中准确反应1min，记录550nm 处1min 后的吸光值A2，计算A=A1-A2。

注意：

若A1-A2 大于0.2，需将样本用试剂二稀释适当倍数，使A1-A2 小于0.2，可提高检测灵敏度。

复合体Ⅳ活⼒单位的计算：

1、组织中复合体Ⅳ活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化降解1nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力（U/mg prot）=反应总体积（840μL）÷样本体积（40μL）÷反应时间(1min)÷细胞色素C 消光

系数（19.1×10-3）×A÷蛋白浓度（mg/mL）=1099×A ÷蛋白浓度（mg/mL）

(2)按样本鲜重计算

单位定义：每g 组织在反应体系中每分钟催化降解1nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力（U/g 鲜重）=反应总体积（840μL）÷样本体积（40μL）÷反应时间(1min)÷细胞色素C 消光系

数（19.1×10-3）×A÷样本鲜重（g/mL）=1099×A ÷样本鲜重（g/mL）

2、细菌或细胞中复合体Ⅳ活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化降解1nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力（U/mg prot）=反应总体积（840μL）÷样本体积（40μL）÷反应时间(1min)÷细胞色素C 消光

系数（19.1×10-3）×A÷蛋白浓度（mg/mL）=1099×A÷蛋白浓度（mg/mL）

(2)按细菌或细胞密度计算

单位定义：每1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化降解1nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力

单位。

复合体Ⅳ活力（U/104 cell）=反应总体积（840μL）÷样本体积（40μL）÷反应时间(1min)÷细胞色素C 消光系

数（19.1×10-3）×A÷细菌或细胞密度（104/mL）=1099×A÷细菌或细胞密度（104/mL）

 

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