产品简介：

NAD 是糖酵解和TCA 循环的主要氢受体，生成的NADH 经呼吸电子链传递把电子交给氧，在合成ATP

的同时，形成大量的ROS，同时NADH 再生为NAD。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝

大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD 比值的高低可用于评价糖酵解和TCA 循环的强弱。

较高的NAD(H)及NADH/NAD 比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态，NADH/NAD 比值升高也

可抑制糖酵解和TCA 循环。另外，NAD 降解产物具有非常重要的调控作用。

NAD 和NADH 在254 nm 下有吸收峰，利用高效液相色谱法在相应波长下测定其含量。

试验中所需的仪器和试剂：

高效液相色谱仪、低速离心机、溶剂抽滤装置、针头式过滤器（水系，50 个，0.22μm）、滤膜（水系和

有机系各2 个，0.45μm）、C18 柱（4.6 ×150 mm）、可调式移液器、样品瓶（50 个，2mL）、乙*（120 mL）、

甲醇（色谱级，300 mL）、蒸馏水

注：若用自动进样器，需要样品瓶，测定时将不少于1mL 的样品或标准品加入样品瓶中。无自动进样

器，需手动进样时，不需要样品瓶，用进样针将不少于20ul 的样品或标准品打入进样阀。

产品内容：

试剂一：粉剂1×1 瓶，粉剂2×1 瓶，4℃保存；临用前用少量蒸馏水将粉剂1 和粉剂2 溶解后倒入容量

瓶中，用蒸馏水定容至100mL，形成NAD 和NADH 提取液（注：试剂瓶中的粉剂要冲洗干净），4℃保存

3 个月；

试剂二：粉剂1×1 瓶，粉剂2×1 瓶，粉剂3×1 瓶，4℃保存；临用前用少量蒸馏水将粉剂 1、粉剂2 和

粉剂3 溶解后倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，形成流动相缓冲液基质（注：试剂瓶中的粉剂要冲

洗干净）, 4℃保存3 个月。

试剂三：NAD 标准品5mg×1 支，-20℃保存。加入1mL 试剂一，配成5mg/mL 溶液，现配现用，用不

完的试剂-20℃保存。

试剂四：NADH 标准品5 mg×1 支，-20℃保存。加入1mL 试剂一，配成5mg/mL 溶液，现配现用，用

不完的试剂-20℃保存。

操作步骤：

一、实验前的准备工作：

1. 将双蒸水1000 mL、流动相缓冲液基质1000 mL、甲醇300 mL 和乙*120 mL 用0.45μm 的滤膜抽

滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱。（注：双蒸水和缓冲液基质用水系滤膜抽滤，乙*用有机系

滤膜抽滤）。

2. 流动相的配制：将抽滤完毕的流动相缓冲液基质1000 mL 与乙*配比为9：1（v/v），即取900mL

缓冲液基质与100 mL 乙*混合。[每个样品需要约12mL 流动相，流动相用量（mL）=12mL×样品数量+跑

基线用量（约50mL），流动相的用量请根据样品数量用多少配多少]。

3. 将抽滤完毕的甲醇和双蒸水配比成100%的甲醇， 10%的甲醇，双蒸水各250 mL。

4. 将2 和3 中的溶剂超声30 分钟，以脱去溶剂中的气泡，防止堵塞色谱柱。

二、辅酶ⅠNAD(H)的提取：

组织的处理：准确称取组织重量，按重量体积比（g/mL）加9 倍试剂一，提取NAD 和NADH，制成

10%匀浆。20000 g/min 离心30 min，取上清液用0.22μm 水系针头式过滤器过滤后待测，同时测定组织蛋白

含量。

细胞处理：收集于60 mL 细胞，离心菌体经高压冷冻干燥12 h 后，加入2 mL 试剂一。超声破壁细胞

(950 W，30%，15 min，工作1 s，间隔2 s)，再经10,000r 4℃高速离心40s，上清用0.22μm 水系微孔滤膜

过滤后直接上柱检测。

三、辅酶ⅠNAD(H)含量测定操作步骤：

1. 开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开empower 软件，在方法组中设置进样量20 μL，流速0.8

mL/min，保留时间15min，检测波长254nm,设置完毕保存方法组。

2. 用100%的甲醇、10%的甲醇、双蒸水按甲醇浓度从大到小的顺序洗色谱柱30min。

3. 用流动相洗柱子，待基线稳定后开始加样。

4. 加入标准品20 μL，在15min 内可分离NAD 和NADH， NAD 的保留时间在3min 左右，NADH 的保

留时间在7min 左右（柱子不同，保留时间有差异），计算不同浓度的NAD 和NADH 标准品的峰面积。

5. 加入样品20 μL，在相应保留时间处检测NAD 和NADH 的峰面积。

辅酶ⅠNAD(H)含量的计算：

1. NAD含量的计算

NAD 标准曲线的绘制：

将5mg/ml 的NAD 标准品用双蒸水分别稀释成110 μg/ml、80 μg/ml、50 μg /ml、和20 μg /ml 的NAD

标准品溶液，计算不同标准品溶液的峰面积。

计算标准曲线公式为: y = 25069χ- 26754（χ 为NAD 浓度，μ g/ml；y 为峰面积）

推出：χ=（y + 26754）÷25069（χ 为NAD 浓度，μg/ml；y 为峰面积）

NAD 含量（μg/mg prot）=（样品峰面积+26754）÷25069÷蛋白浓度（mg/mL）

NAD 含量（μg/g mass）=（样品峰面积+26754）÷25069÷样本鲜重（g/mL）

2. NADH 含量的计算

NADH 标准曲线的绘制：

将5mg/ml 的NADH 标准品用双蒸水分别稀释成200 μg/ml、150 μg/ml、100 μg/ml 和50 μg/ml 的NADH

标准品溶液，计算不同标准品溶液的峰面积。

计算标准曲线公式为: y = 13275χ+35717（χ 为NADH 浓度，μ g/ml；y 为峰面积）

推出：χ=（y – 35717）÷13275（χ 为NADH 浓度，μ g/ml；y 为峰面积）

NADH 含量（μg/mg prot）=（样品峰面积 - 35717）÷13275÷蛋白浓度（mg/mL）

NADH 含量（μg/g 鲜重）=（样品峰面积 - 35717）÷13275÷样本鲜重（g/mL）

注：标准品的稀释倍数要根据样品中NAD 和NADH 浓度确定，样品中NAD 和NADH 的峰面积必须落在

不同浓度的NAD 和NADH 标准品的峰面积之内，该标准曲线紧供参考。

Solarbio

Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd

Tel: 010-56371210

Fax: 010-56371281/82

Http://www.solarbio.cn