NADP-苹果酸酶（Malic enzyme，NADP-ME）试剂盒说明书

微量法

BC1125- 100管/96样 Solarbio 100管/96样 1080.00元

产品简介：

ME广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙***酸和CO2，以及伴随NAD(P)⁺的还原反应，是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物ME活性测定较多，已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将ME分为NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。

NADP-ME催化NADP⁺还原成NADPH，在340nm下测定NADPH增加速率。

试验中所需的仪器和试剂：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1 mL石英比色皿和蒸馏水。

产品内容：

提取液：60mL×1瓶，4℃保存。；

试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×2支，4℃保存；用时每支加1mL双蒸水充分溶解备用；

试剂四：粉剂×2支，-20℃保存；用时每支加500μL双蒸水充分溶解备用。

操作步骤：

一、NADP-ME提取：   

1、 细菌、细胞或组织样品的制备 ： 

细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次），8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：称取约0.1g组织，加入1mL试剂一进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

二、测定操作表：

试剂名称（μL）	测定管
试剂一	600
试剂二	225
试剂三	30
试剂四	15
样本	30

将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中，混匀后在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种），340 nm波长下记录初始吸光度A1和反应1min后的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。

注意事项：

1、若A2-A1大于0.5，需将酶液用提取液稀释，使A2-A1小于0.5，可提高检测灵敏度。

2、实验时，试剂三、试剂四和样本在冰上放置，以免变性和失活。试剂一37℃或25℃水浴放置。

3、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

4、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

NADP-ME活力计算：

1、血清（浆）NADP-ME活力的计算

单位的定义：每升血清（浆）在反应体系中每分钟消耗1 μmol的NADH定义为一个酶活力单位。 

NAD-MDH（U/L）=反应总体积（800μL）÷样本体积（20μL）÷反应时间(1min)÷NADH消光系数（6.22×10^-3）×ΔA= 6430 ×ΔA 

2、组织中NADP-ME活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-ME（U/mg prot）＝反应总体积（900μL）÷样本体积（30μL）÷反应时间(2min)÷NADPH消光系数（6.22×10^-3）×ΔA ÷蛋白质浓度（mg/mL）=4824×ΔA÷蛋白质浓度（mg/mL）

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-ME（U/g 鲜重）＝反应总体积（900μL）÷样本体积（30μL）÷反应时间(2min)÷NADPH消光系数（6.22×10^-3）×ΔA ÷样品质量（g/mL）=4824×ΔA÷样品质量（g/mL）

3、细菌或培养细胞中NADP-ME活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-ME（U/mg prot）＝反应总体积（900μL）÷样本体积（30μL）÷反应时间(2min)÷NADPH消光系数（6.22×10^-3）×ΔA ÷蛋白质浓度（mg/mL）=4824×ΔA÷蛋白质浓度（mg/mL）

（2）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-ME（U/10⁴ cell）＝反应总体积（900μL）÷样本体积（30μL）÷反应时间(2min)÷NADPH消光系数（6.22×10^-3）×ΔA ÷细菌或细胞密度（10⁴/mL）=4824×ΔA ÷细菌或细胞密度（10⁴/mL）