Hygromycin B 潮霉素B
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品牌: roche

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 作用机制:  
潮霉素B是由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素,通过抑制蛋白质合成而杀死细菌、真菌和高等真核细胞。潮霉素B通过干扰70S核糖体易位和诱导对mRNA模板的错读而抑制蛋白合成。目前常用于筛选和维持培养含潮霉素抗性基因的原核或真核细胞。 
抗性基因: 
对潮霉素B的抗性源自编码潮霉素B***酸转移酶(Hph)的基因。至今发现两种来源: 
► Streptomyces hygroscopicus产生的Hph抗性基因;
► Escherichia coli,Klebsiella pneumoniae内质粒携带的Hph抗性基因(常用);  
生物应用: 
1)   筛选和维持培养稳定转染Hph+载体的原核细胞或真核细胞(植物细胞和哺乳动物细胞); 
2)   由于作用模式的差异,常与G418 (GeneticinTM),Zeocin 和blasticidin S联合使用,筛选稳定转染两个不同载体的细胞株 
3)抗病毒剂,由于潮霉素B选择性渗透进入因病毒感染增强通透性的细胞,而且具有抑制翻译的功效;
4)作为驱虫药加入动物饲料; 
应用浓度: 
潮霉素B用来筛选稳转株的工作浓度需要根据细胞类型,培养基,生长条件和细胞代谢率而变化。推荐使用浓度为50-1000 μg/mL,最佳浓度需要杀灭曲线来确定。 
哺乳动物细胞·200-500 μg/mL;细菌/植物细胞·100-300 μg/mL;真菌·300-1000 μg/mL; 
产品使用:
使用一:杀灭曲线确定最佳杀死浓度(仅作参考,因个人检测体系而异)
(1)往组织培养级的96孔板内加入未转染细胞,细胞密度约50-200细胞/孔;细胞贴壁之后,往每孔加入含不同浓度(如50-1000μg/mL,至少5个浓度)潮霉素B的200μL新鲜培养基;
(2)37℃,5% CO2培养箱孵育细胞10-14天;
(3)培养5-7天后更换新的培养液,培养液内含有相应浓度的潮霉素B;
(4)10-14天后使用细胞增殖方法如MTT,CCK-8等评估细胞活力;也可以通过检测细胞克隆数或百分比汇合率来确定毒性效应。一般选择在10-14天能够杀死所有细胞的最小浓度为最佳筛选浓度。
使用二:筛选稳定转染细胞
(1)         对于贴壁细胞,直接吸去60mm培养皿内的转染细胞培养基,然后加入含有潮霉素B的新鲜培养基5-6ml;对于悬浮细胞,无菌条件250x g,离心10min除去旧的转染细胞培养基,然后悬浮在约5ml的含潮霉素B的新鲜培养基;
(2)         5-7天后,如上方法更换含有潮霉素B的新鲜培养基;
(3)         再孵育细胞5-7天;
(4)         10-14天孵育后,培养体系中只含有能够表达潮霉素B抗性表型的活细胞。因此筛选之后如步骤一,更换不含潮霉素B的新鲜培养基。 

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小鼠羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)ELISA试剂盒典型操作流程:

1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2. 设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL

3. 样本孔中加入待测样本50μL;空白孔不加。

4. 除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min

5. 弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(350μL),静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。

6. 每孔加入底物AB50μL37℃避光孵育15min

7. 每孔加入终止液50μL15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。

Elisa试剂盒操作流程

 

小鼠羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)ELISA试剂盒江莱生物实验中心:

Elisa试剂盒实验中心拍摄图

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