I. 介绍   

AccuPower® RocketScript^TM RT PreMix是将逆转录反应除引物和模板外所有成分预混合、并分装到8联排管中的冻干粉逆转录试剂，使用极其简便，无需冰上操作。它是以带Poly(A)尾或总RNA为模板合成第一链cDNA的最佳试剂。可合成从100 bp到10 kb以上的片段，样本量可以是1 pg - 1 ug 的RNA。具有非常灵活的实验优化体系，逆转录温度可在42 - 70℃之间进行优化。

 

II. 应用

·    标准的RT和RT-PCR

·    Real-Time PCR

·    克隆

·    基因表达分析

 

III．试剂盒组份

·    RT Premix（已分装到8联排单管内，冻干粉形式，包括：逆转录酶、Buffer、dNTPs、RNase、稳定剂等）

·    引物（Oligo dT20、N6随机引物，各10nmole，N12随机引物，5nmole，冻干粉形式）

·    DEPC水，2.5 ml

 

IV. 原理

AccuPower® RocketScript^TM RT PreMix利用改造的M-MLV酶，大大增强了逆转录酶的耐高温性。在高温反转录下，RNA的双链结构完全打开，非常有效地改善了RNA的复杂二级结构对逆转录反应的扩增效率和全长cDNA的合成的影响，增强了逆转录反应的灵敏度、特异性和产量。

V. 操作注意事项

·    整个操作过程要带上手套进行自身保护。

·    整个操作过程要严格防止RNA酶的污染，所有需要用到的仪器、耗材和水都要进行去RNA酶处理。

·    加样时要在独立的房间或超净台中进行操作。

 

VI. 操作步骤

- cDNA合成 [ 20 μl反应体系]

1. 开始之前准备好Total RNA，DEPC-water，Oligo dT、 随机引物或基因特异性引物等。

2. 将RNA 与引物混合后，70℃，孵育5分钟。

3. 将孵育后混合物加入到装有AccuPower^® RocketScript^TM RT PreMix的8联排管中。

      Note：1.总RNA提取后要做质量控制，保证RNA的纯度和完整性（吸光度260nm/280nm>1.8，电泳图谱无降解）

              2.引物溶液的配置：5nmole引物加入50ul DEPC水，即为100pmole/ul浓度。
反应体系的配制：

反应组份	加入量
Total RNA	推荐1ng ~100ng，最多1ug
Oligo dT 或 随机引物 单独 使用	100 pmoles
Oligo dT 与 随机引物 同时 使用	各50 pmoles
Specific Primer	10 pmoles

Note：1. 20ul反应体系最多可放入1ul的总RNA,最少可低至1pg的总RNA。

2. Oligo dT与随机引物同时使用可有效将mRNA反转录为全长cDNA。

4. 加入DEPC水到AccuPower^® RocketScript^TM RT PreMix管中，定容至20 μl，冻干粉体积可忽略不计。

5. 吹打4-6次，使冻干粉迅速溶解后离心。

6. 按照如下条件进行逆转录反应。

Temperature	Time
42 –70℃ （推荐50℃，温度优化见备注部分）	15min - 1 h （时间优化见备注部分）
Deactivation
95℃	5 min

7．合成的cDNA短期可储存于4℃，长期储存请置于-20℃。