2×Hieff™ HS Pfu Master Mix2×产品描述

2×Hieff^TM HS Pfu Master Mix是即用型的PCR预混合溶液，包含Hieff^TM HS Pfu DNA Polymerase，dNTP以及优化的缓冲体系，只需加入引物和模板即可进行扩增，大大简化实验的操作步骤，提高了高通量操作和实验结果的重现性。体系中含有的保护剂使得Master Mix 经过反复冻融后仍可维持稳定的活性。PCR产物为平末端。

 2×Hieff™ HS Pfu Master Mix2×产品组分

 

冰袋（wet ice）运输。收到产品后放到-20 ºC保存。

 2×Hieff™ HS Pfu Master Mix2×质量控制

核酸外切酶残留检测：本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在74 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。

核酸内切酶残留检测：20 μl本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在74 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。

大肠杆菌残留DNA检测: 50 μl体系中，以ddH₂O为模板，扩增E.coil 16s rDNA基因。35个循环后扩增产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，无扩增条带。

功能检测1：以100 ng人基因组DNA为模板扩增α-1-antitrypsin基因。30个循环后取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察到单一的8.2 kb条带。

功能检测2：以10 ng λDNA为模板扩增30个循环，取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察到单一的15 kb条带。

 2×Hieff™ HS Pfu Master Mix2×应用实例

1.        反应体系配制：

模板种类/扩增长度	＜1 kb	1 kb～10 kb	＞10 kb
基因组DNA	50 ng～250 ng	100 ng～300 ng	150 ng～400 ng
质粒或病毒DNA	10 pg～20 ng	10 pg～20 ng	1 ng～30 ng
cDNA	1～5 μl(不超过PCR反应总体积的1/10)

注：§ 针对不同模板的最佳反应浓度有所不同，下表为50μl反应体系推荐模板使用量，仅供参考。

2.        一般PCR反应条件设置：

注：a. 推荐大多数模板的预变性温度为95℃， 时间为：质粒或病毒DNA，30 sec，基因组2 min，cDNA 3 min；对于高GC含量模板，预变性温度需提升至98℃，变性时间为2～4 min；对于超过10 kb的扩增子，预变性温度需降低至92℃，变性时间不超过2 min。

b. 对于大多数模板在95℃变性时间设为5～10 sec即可。对于高GC含量模板，变性温度需提升至98℃；对于超过10 kb的扩增子，变性温度需降低至92℃，并延长变性时间至15 sec。

c. Pfu DNA Polymerase能够促进模板和引物高效退火。一般来说，退火温度设置为引物Tm值±3℃范围内之间即可。如果需要，可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的最适温度。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状。因此，推荐退火时间设置为10 sec即可。对于一些困难模板，退火时间可在10～30 sec之间调整。

d. 对于大多数扩增反应，延伸过程可在72℃进行。对于超过10 kb的扩增片段，需降低延伸温度至68℃。延伸时间取决于扩增片段的长度和模板的复杂性。使用质粒等复杂程度较低的DNA做模板时，可使用15 sec/kb的延伸时间；使用基因组, cDNA等复杂程度较高的DNA做模板时，延伸时间应为30 sec/kb。太长的延伸时间会导致非特异性扩增增加，因此延伸时间请勿超过30 sec/kb。

3.        长片段PCR指南：

*使用高质量的模板；

*使用长引物。将引物加长至Tm值68～72℃，把退火/延伸温度合并为68℃。这样可以显著提高扩增特异性；

*推荐反应条件设置：

循环步骤	温度	时间
预变性	92℃	2 min
变性	92℃	5～10 sec	25～35循环
延伸	68℃	15～30 sec/kb
彻底延伸	68℃	5～10 min

4.        高GC含量模板PCR指南：

*使用高质量的模板；

*提高变性温度至98℃；

*推荐反应条件设置：

循环步骤	温度	时间
预变性	98℃	3 min
变性	98℃	10 sec	25～35循环
退火	45℃～72℃	10～30 sec
延伸	72℃	15～30 sec/kb
彻底延伸	72℃	5～10 min