产品描述: Pfu DNA聚合酶为最常用的高保真DNA聚合酶,在需高保真的PCR反应中广范使用,然而Pfu酶扩增灵敏度不高,延伸速度缓慢(0.5kb/分钟)给众多的使用者带来了不便。针对普通Pfu酶的以上缺点,SinoBio采用分子进化技术对普通Pfu酶进行改造,制备的新型聚合酶Fast Pfu酶具有快速、高灵敏度、抗干扰能力强等特点,是新一代的 高保真DNA聚合酶。使用Fast Pfu能获得更理想的扩增结果,并大幅度缩短扩增反应时间。 特点: - 高保真:具有同Pfu酶相同的保真度,为普通Taq酶的10倍。
- 快速:Fast Pfu扩增速度为普通Pfu酶的数倍,72oC保温30秒可延伸1kb以上。
- 高效:以λDNA为模板,扩增长度可达12kb,能高效扩增≤6kb片段;对于人基因组DNA等复杂模板,能有效扩增出3kb特定基因片段。
- 独特配方的5×Buffer:使PCR扩增反应更加稳定、灵敏、高效。
产品用途: 用于要求保真度比较高的PCR反应,包括克隆PCR、DNA片段拼接、引入突变、全基因合成等(参见 SinoBio 实验方案) 使用建议: Fast Pfu DNA聚合酶产生的PCR产物为平滑末端,无3'端"A"突出, 其PCR产物的克隆有两种方案: 1.PCR前引物进行5'端加***修饰或将PCR产物***酸化处理后再直接克隆于平滑末端的载体中(参见 Sinobio 实验方案)。 2.将产物3'末端加A后再与T-Vector连接(参见 SinoBio 实验方案)。
*由于Fast Pfu DNA聚合酶的校对活性可引起引物从3′端被部分降解。因此在设计引物时应适当增加引物的长度,理想的引物长度为 20-30碱基。另外为了减少由3′-5′外切酶活性引起的引物降解, 尽量在冰上配置反应体系,并最后加入Fast Pfu酶。 图例一)5 0 μ l扩增体系中,分别以50ng~0.05ng人基因组DNA为模板,可对特定基因片段(1.2kb)进行很好的扩增。 模板量: 泳道1:50ng; 泳道2:5ng; 泳道3:0.5ng; 泳道4:0.05ng; 泳道M:DL2000 DNA Marker | 
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| 产品包装: Fast Pfu DNA聚合酶 (5U/ul) | 50μl | dNTP混合液(各10mM) | 200μl | 5×Fast Pfu Buffer with Mg2+ | 2ml | 10×Super Taq Plus Buffer with Mg2+ | 1ml |
质量保证: 经多次柱纯化,SDS-PAGE胶检测仅可见清晰单一的目的条带;PCR方法检测无大肠杆菌DNA残留,无核酸内、外切酶污染。 活性定义: 在74oC条件下,30分钟内催化10nmol dNTP的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量为一个单位。 常用反应体系(50μl) 5×Fast Pfu Buffer* | 10μl | 上游引物 | 0.2-1.0μM(终浓度) | 下游引物 | 0.2-1.0μM(终浓度) | dNTP(各10mM) | 1.0μl | 模板 | 50ng(质粒) 10ng-1μg(基因组) | Sinobio Fast Pfu | 1-0.25μl(1.25U) | ddH2O | 至50μl | *Mg2+终浓度为2mM |
常用PCR循环 当扩增片段<3K: 94oC | 1分钟30秒 | 30次 循环 | 94oC,30秒 57oC,30秒 72oC,根据产物长度调整,30秒/1kb | 72oC | 5分钟 | 4oC | 保温 |
当扩增片段≥3K(推荐引物长度≥30bp): 94oC | 20秒 | 30次 循环 | 94oC,5秒 68oC,根据产物长度调整,30秒/1kb | 72oC | 5分钟 | 4oC | 保温 |
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