Percoll 细胞分离液 | |||
型号:null 产品货号: 17-0891-01 | |||
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品牌: pharmacia | |||
Percoll 细胞分离液 图片▼ ![]() ![]() Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞 (一) 原理 Percoll是一种包有乙***的硅胶颗粒。渗透压很低(<20mosm/kg H2O), 粘度也很小,可形成高达1.3g/ml密度,采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200~1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低,所形成的梯度十分稳定。此外,Percoll不穿透生物膜,对细胞无毒害,因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒,还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。 (二)操作方法及注意事项 1.不同浓度(密度)Percoll溶液的制备: 先用9份Percoll与1份8.5% NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压,然后用生理溶液(0.85% NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。 Percoll浓度(%) 70 60 50 40 30 20 比重g/ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031 2.不连续密度梯度Percoll层的制备: 先将试管壁用牛血清湿润,除去多余血清,这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下,使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置,有时相邻两层Percoll比重相差不大时,可将Percoll液放入注射器中,小针头斜面紧贴管壁,任其自然慢慢流下。 3.装样:样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异,一般加样体积不宜过大,细胞浓度也不可过高,否则会影响细胞的分离和回收。 4.离心:一般采用离心力为400g,时间20~25min。由于多层Percoll之间密度差别不大,因此离心机加速、降速时要慢,要平稳。 5.取样:当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时,可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于Percoll层中,则需要逐层收集。收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。 (三)分离纯化细胞举例 1.富含NK活性大颗粒淋巴细胞(LGL)的纯化:按顺序由下向上逐层加50%、47.5%、45%、42.5%和40%五种不同密度的Percoll,如用10ml试管(或塑料管)分离,每层Percoll约1.2~1.5ml,初步从外周血中分离的PBMC细胞1×108悬于1ml培基中,按要求装样、离心和取样。一般富含NK杀伤活性的LGL细胞位于42.5%与45%Percoll界面以及上下二层的Percoll液中。 2.纯化淋巴母细胞和除去死细胞:分别叠加50%和30%Percoll液。收取经PHA(或其它抗原、有丝分裂原)刺激PBMC,或含有较高比例异型的PBMC(如肾综合征出血热患者),按要求装样、离心和取样。位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞;两层Percoll之间为淋巴母细胞,纯度和回收率在80%以上,位于30%Percoll表面是死细胞。收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。 (四) 人不同血细胞的漂浮密度 表 人不同血细胞的漂浮密度 ──────────────┬────────────────── 细 胞 漂浮密度 │ 细 胞 漂浮密度 ──────────────┼────────────────── 红细胞 1.09-1.11 │淋巴细胞 1.052-1.077 粒细胞 │ B淋巴细胞 1.062-1.075 嗜酸性 1.09-1.095 │ T淋巴细胞 1.065-1.077 嗜中性 1.080-1.085 │ 淋巴母细胞 1.065-1.077 单核细胞 1.050-1.066 │自然杀伤细胞 1.050-1.070 血小板 1.030-1.060 │
Percoll分离液是一种经过聚乙***处理过的硅胶颗粒,经过高速离心后可形成连续密度梯度,由于Percoll扩散常数低,所形成的梯度十分稳定。Percoll分离液采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200~1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。此外,Percoll分离液不穿透生物膜,对细胞无毒害,因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒,还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。Percoll常用于分离和传话植物原生质体、核、叶绿体、和线粒体。 Percoll分离液的配置与使用 1、不同浓度(密度)Percoll分离液的制备: 先用9份Percoll分离液与1份8.5% NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压,然后用生理溶液(0.85% NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。 2、不连续密度梯度Percoll层的制备: 先将试管壁用牛血清湿润,除去多余血清,这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下,使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置,有时相邻两层Percoll比重相差不大时,可将Percoll液放入注射器中,小针头斜面紧贴管壁,任其自然慢慢流下。 3、装样:样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异,一般加样体积不宜过大,细胞浓度也不可过高,否则会影响细胞的分离和回收。 4、离心:一般采用离心力为400g,时间20~25min。由于多层Percoll之间密度差别不大,因此离心机加速、降速时要慢,要平稳。 5、取样:当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时,可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于Percoll层中,则需要逐层收集。收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。 Percoll细胞分离液的优点 Percoll渗透性低、不穿透细胞、密度高、无毒害,是目前较理想的介质。Percoll密度梯度离心已被多次成功地用于动物细胞及其细胞器的分离,纯化了包括人血液细胞、骨髓细胞、红血球细胞、白血球细胞、淋巴细胞、肝细胞等在内的十余种动物细胞。 Percoll细胞分离液注意事项: 1、Percoll细胞分离液在储存及孵育过程中避免将实际保留在强光中。 2、试剂瓶盖需盖紧,防止蒸发和污染。 适合分离细胞、亚细胞成分和大病毒(>70s),渗透压均匀,粘度低,可调至生理离子强度和pH,分离条件温和,对细胞无毒性,可以灭菌消毒。密度为1.13g/ml。 牛血清白蛋白[组份五] Albumin from bovine serum[BSA] Roche[分] 5g 牛血清白蛋白[组份五] Albumin from bovine serum[BSA] Roche[分] 5g*10 **** 胆固醇 Cholesterol 国产 100g **** 胆固醇 Cholesterol 国产 100g*10 **** 琼脂糖 Agarose 西班牙 100g **** 琼脂糖 Agarose 西班牙 100g*10 **** 琼脂糖 Agarose 西班牙 100g **** 琼脂糖 Agarose 西班牙 100g*10 G-418 G-418[Geneticin] Invitrogen 100mg G-418 G-418[Geneticin] Invitrogen 1g 羧苄青霉素 Carbenicillin 2Na Amresco[分] 100mg 羧苄青霉素 Carbenicillin 2Na Amresco[分] 100mg*10 琼脂粉 Agar Japan[分] 500g 琼脂粉 Agar Japan[分] 500g*10 二甲基亚砜 Dimethyl Sulfoxide[DMSO] Sigma 100ml 二甲基亚砜 Dimethyl Sulfoxide[DMSO] Sigma 500ml 二甲基亚砜 Dimethyl Sulfoxide[DMSO] Sigma[分] 100ml 二甲基亚砜 Dimethyl Sulfoxide[DMSO] Sigma[分] 100ml*10 二甲基亚砜 Dimethyl Sulfoxide[DMSO] Amresco[分] 100ml 二甲基亚砜 Dimethyl Sulfoxide[DMSO] Amresco[分] 100ml*10 ***化丙碇 Propidium iodide[PI] Sigma[分] 10mg ***化丙碇 Propidium iodide[PI] Sigma[分] 100mg D8220 二硫苏糖醇 1,4-Dithiothreitol[DTT] Merck 1kg D8220二硫苏糖醇 1,4-Dithiothreitol[DTT] Merck 1kg*3 D8220 二硫苏糖醇 1,4-Dithiothreitol[DTT] Merck[分] 1g D8220 二硫苏糖醇 1,4-Dithiothreitol[DTT] Merck[分] 5g A8180 氨苄青霉素 [钠] Ampicillin Sodium Salt Amresco[分] 1g A8180 氨苄青霉素 [钠] Ampicillin Sodium Salt Amresco[分] 5g 甲酰胺 Formamide Amresco[分] 100ml 甲酰胺 Formamide Amresco[分] 100ml*5 M8200 甲叉双丙烯酰胺 N,N′-Methylenebisacrylamide Amresco[分] 25g M8200 甲叉双丙烯酰胺 N,N′-Methylenebisacrylamide Amresco[分] 25g*10 G8190 甘油 Glycerol Amresco[分] 100ml G8190 甘油 Glycerol Amresco[分] 100ml*10 X80505-溴-4-氯-3-吲哚-beta-D-半乳糖苷 X-gal Amresco[分] 100mg X8050 5-溴-4-氯-3-吲哚-beta-D-半乳糖苷 X-gal Amresco[分] 100mg*10 利福平 RifampicinSolarbio[分] 250mg 利福平 Rifampicin Solarbio[分] 1g 利福平 Rifampicin sigma 250mg 利福平 Rifampicin sigma 1g T8090 四甲基*** TEMED Sigma[分] 100ml 潮霉素B Hygromycin B Roche 1g 姬姆色素染料 Giemsa stain Amresco[分] 1g 姬姆色素染料 Giemsa stain Amresco[分] 1g*10 无氨基酵母氮源 YNB [分] 100g 纤维蛋白原[分] 100mg I8070 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 IPTG Merk 1kg I8070异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 IPTG Merk[分] 1g I8070异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 IPTG Merk[分] 5g N8140氯化**四氮唑兰 Nitrotetrazoliumbluechloride[NBT] Amresco[分] 100mg I8040牛胰岛素 *** Sigma[分] 25mg |