5 mL

Serum-Free supplement A (1000x)

500 μL

Serum-Free supplement B (1000x)

500 μL

2-Mercaptoethanol (1000x)

500 μL

LIF (Mouse)

250 μL

操作说明：

小鼠胚胎干细胞无血清培养基的制备

1.    在实验开始的一小时前，将培养基里的serum replacement, LIF, Penicillin-Streptomycin solution, 以及Glutamax等添加物成分放置于2-8°C进行溶解；Serum-free supplement A和Serum-free supplement B添加物成分则放置于室温避光溶解。溶解完成后，轻轻摇晃试剂管使冻融的成分充分混合。

注意： 对于微量因子，可将试剂管进行短暂离心（5000g），以确保添加试剂能全部收集。

2.     使用70%酒精消毒试剂盒中各管/瓶的开口外壁。

3.     待试剂管上的酒精挥发干净后，无菌打开各个试剂管。

4.     将各个添加物成分，按试剂体积大小，逐一加入到小鼠胚胎干细胞无血清基础培养基中。

5.     无菌吸取基础培养基洗涤各管子，尽可能的将添加物的所有组分完整的加入基础培养基中。

6.     重复步骤<5>两到三遍。

7.     轻轻摇晃基础培养基瓶子，使里面的各种成分充分混匀。将配制好的完全培养基放置于4℃保存。

注意： 本公司的产品均为无菌分装，但是为确保无菌，建议全部试剂混合之后，对完全培养基进行再次过滤除菌（0.22μm）。

培养基使用规程: 

培养表面的明胶包被

为了使小鼠胚胎干细胞在无血清无饲养层的条件下更好的生长，强烈建议对培养器皿表面进行明胶包被。

1.     加入足量的0.1%的明胶溶液（Gelatin），使之覆盖整个培养器皿底部。室温放置过夜（6小时以上）。

2.     使用前，尽量吸去明胶溶液。在洁净工作台中，打开培养器皿，让残留的明胶溶液全部风干。

小鼠胚胎干细胞培养条件的转换（有血清/Feeder条件过渡至无血清条件）

1.     按常规方法将有血清/Feeder培养的小鼠胚胎干细胞进行消化，250g，5分钟进行离心收集细胞。

2.     用原血清培养基重悬小鼠胚胎干细胞，全部接种至事先包被了明胶的培养器皿中，放置于37°C、5% CO₂的培养箱中培养30-40分钟。目的是为了尽可能去除原细胞群体中的Feeder细胞。

3.     30-40分钟后（具体时间以Feeder贴壁程度来判断），收集上清培养基，250g，5分钟进行离心。

4.     吸走上清培养基，用小鼠胚胎干细胞无血清完全培养基重悬细胞。按实验所需比例接种在预先包被了明胶的培养器皿中。

5.     接种之后，加入足量的完全培养基，放置在37°C、5% CO₂的培养箱中培养。

6.     翌日，观察第一代无血清培养基培养的小鼠胚胎干细胞，更换新鲜的无血清培养基，以去除上一代残留的Feeder细胞，以及因不适应无血清条件而凋亡的ES细胞。

稳定性/存储：

1.     所有的产品都需要避光保存。

2.     无血清基础培养基在2-8°C可保存一年。其他添加物在-20°C可保存两年。所有产品一旦超过标签注释的有效期，必须放弃使用。

3.     配制成完全培养基后，避光保存在2-8°C可存放2-3周。

4.     为了更好的使用效果，请勿对试剂进行反复冻融。

质量控制：

OriCell^TM小鼠胚胎干细胞无血清完全培养基均使用赛业OriCell^TM小鼠胚胎干细胞进行性能测试。

产品检测标准包括：

·           微生物检测（细菌、真菌、霉菌及支原体）

·           pH检测

·           渗透压

·           内毒素       

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