英文名称： two-photo microscope
德国Lavision Biotec |  |
---双光子荧光显微镜TriM Scope |
双光子吸收/激发技术的原理： 在强光激发下，分子同时吸收两个光子，从基态跃迁到两倍光子能量的激发态的过程。两个光子可以是相同波长的，也可以是不同波长的，但必须是同时吸收（两个光子到达被激发分子的时间间隔小于1飞秒）。可以这样理解，先吸收一个光子的能量跃迁到一个虚拟的中间态，然后再吸收一个光子的能量跃迁到激发。
双光子显微镜的优点：
☆ 光损伤小：由于双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为激发光源，这一波段的光对活体细胞和组织的光损伤小，适用于长时间的研究；
☆ 穿透能力强：相对于紫外光，可见光和近红外光都具有更强的穿透能力，因而受生物组织散射的影响更小，解决对生物组织中深层物质的层析成像研究问题；研究表明，共聚焦荧光成像的成像深度一般在50微米左右，而双光子显微镜的成像深度可达1000微米；
☆ 高分辨率：由于双光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光，双光子吸收仅局限于焦点处的体积约为波长3次方的范围内；
☆ 漂白区域小：由于激发只存在于交点处，所以焦点以外的区域都不会发生光漂白现象；
☆ 荧光收集率高：与共聚焦成像相比，双光子成像不需要光学滤波器（共焦针孔），这样就提高了对荧光的收集率，而收集率的提高直接导致图像对比度的提高；
☆ 图像对比度高：由于荧光波长小于入射波长，因而瑞利散射产生的背景噪声只有单光子激发时的1/16，大大降低了散射的干扰；(更多介绍……)
LaVision BioTec的双光子显微镜TriM Scope的独特优势:
☆ 独有的多光束快速扫描模式：用户可根据需要调节光束模式从传统的单光束扫描模式到La Vision BioTec独有的多光束快速扫描模式。
☆ 第一个可用软件调节的双光子显微镜。ImSpector Pro软件支持了先进的扫描模式，并且支持用户在ms毫秒之内切换扫描区域。
☆ 最优的检测效率：TriM Scop可以支持最多达8个 non-descanned PMT, NDD可以是cooled generation III GaAsP PMT或者APD detector可以多传输40%效率的量子。
☆ 唯一能够支持OPO技术的显微镜：OPO技术– 红光和蛋白的激发。
☆ 独有的多光束快速扫描模式：用户可根据需要调节光束模式从传统的单光束扫描模式到La Vision BioTec独有的多光束快速扫描模式，即1、2、4、8、16、31、64束光的不同模式选择。快速扫描模式即可保证最大可允许64束光同时扫描，并且保证最低的样品损伤。
☆ 第一个可用软件调节的双光子显微镜。ImSpector Pro软件支持了先进的扫描模式，并且支持用户在ms毫秒之内切换扫描区域。因此，TriM Scope 是研究光活化、光释放和光漂白（photo activation, uncaging and FRAP ）的理想完美工具。
☆ 最优的检测效率：TriM Scop可以支持最多达8个 non-descanned PMT, NDD可以是cooled generation III GaAsP PMT或者APD detector可以多传输40%效率的量子。
☆ 唯一能够支持OPO技术的显微镜：OPO技术– 红光和蛋白的激发：经典的Ti:Sa激光器成像红光的能力是非常有限的，因为经典的激发波长是1125到1250 nm, 并不在Ti:Sa激光器的转换范围之类。OPO技术解决了这个问题，因为它能传输可调的fs激光脉冲到>1100 nm的范围。
La Vision BioTec革新的技术提供了独特的双光子显微镜-第一代双光子显微镜TriM Scope I：
☆ 用户可根据需要调节光束模式：从传统的单光束扫描模式到La Vision BioTec的多光束快速扫描模式，即1、2、4、8、16、31、64束光的不同模式选择。快速扫描模式即可保证最大可允许64束光同时扫描，并且保证最低的样品损伤，主要有下面三个原因:
Ø 64束光能够提供单光束的64倍荧光强度并且保证低损伤高荧光强度
Ø 保证了高的帧速率
Ø CCD摄像头比PMTs更高灵敏度
☆ TriM Scope 可以提供最多达8个NDD摄像头给经典的单光束扫描显微镜，2个CCD摄像头，1个TCSPC 探测器为FILM（Fluorescence Lifetime Imaging Microscope ）测量。3 个NDD可以安装到靠近物镜的位置，2个 NDD可以插入到传送器。
☆ LaVision BioTec的ImSpector Pro软件支持了先进的扫描模式，并且支持用户在ms毫秒之内切换扫描区域。因此，TriM Scope 是研究光活化、光释放和光漂白（photo activation, uncaging and FRAP ）的理想完美工具。
☆ TriM Scope 还可以结合1个OPO使用，OPO可以转换Ti:Sa激光器的波长从800-880 n转变到1100-1300 nm。因此红光染料或者蛋白质可以被有效地激发出双光子，就保证了很低的漂白率和最深的穿透深度。LaVision BioTec可以同时使用Ti:Sa激光和OPO来扫描，就能同时激发出绿/黄和红光。
LaVision BioTec最新的双光子显微镜-第二代双光子显微镜TriM Scope II具有一些新的特点：
☆ 自动校准的双光子显微镜
☆ 穿透最深的样品深度，并能应用OPO技术
☆ 可升级到LaVision BioTec的64束光分光技术
☆ 多用户使用环境中的双光子显微镜
TriM Scope II双光子显微镜提供了第二代的双光子显微镜，并且在各种使用环境下能够完成快速、深度成像。基本配置是单光束扫描元件，包括正置机身和2个靠近物镜的NDD检测器。作为选件，该显微镜可以配置:
☆ LaVision BioTec专利的光学分光器，用于64路光束的平行扫描
☆ 最多可达到8个NDD检测器
☆ 各种不同的CCD摄像头
☆ LaVision BioTec的快速TCSPS检测器
☆ 用于共聚焦检测的descanned检测器
☆ 预啁啾补偿器
☆ OPO技术
友好的用户界面和自动的光束校准
TriM Scope II是第一个商业化的可用软件调节的双光子显微镜，激光束是由可选的piezo 驱动发光镜，位置是由photo diodes 监测，因此，调整过程非常精确、安全和快速。结合最新的ImSpector软件可以帮助用户操作整个实验而无需花费时间研究显微镜的高级的调节。 尤其是多个用户使用下，TriM Scope II只需要很基础的培训后即可使用。
优化的激发光学：
☆ 成像质量和光束条件: 双光子显微镜的分辨率和穿透, 深度主要取决于聚焦质量和Ti:Sa激光器发射的脉冲波长。选择最佳的部件（激光和物镜之间的所有的光学部件）从而实现最有效地激发和工业标准的光学通量。
☆ 适应物镜和焦距深-可调节光束直径: TriM Scope含有一个triple lens telescope允许客户根据物镜的后孔隙和焦距深度调节激光束的直径。物镜的后孔隙最大的光束直径是24 mm，可以允许使用所有的新的低放大率高数值孔径的物镜。
☆ 物镜: 聚焦质量和分辨率主要取决于物镜，所以需要优化物镜。为达到最佳的适应性，TriM Scope可以搭配主要生产商的绝大多数镜头 (Leica, Nikon, Olympus和Zeiss)。 为达到最佳质量，TriM Scope只使用最优于fs红外脉冲而不损伤激发激光的光学组件 。
☆ 优化的脉冲波长-预啁啾补偿: 双光子显微镜的成像的亮度直接与转换脉冲长度相关，TriM Scope使用预啁啾补偿来保证物体平面的激光脉冲长度< 150 fs。预啁啾补偿器、经典的单光束以及多光束相关器件配合使用(1, 2, 4, 8, 16, 32和64路光束)。TriM Scope I可以与正置、倒置显微镜组合使用，可以配合8个NDD检测器，用于共聚焦检测的descanned检测器，各种不同的CCD摄像头， LaVision BioTec的快速TCSPS检测器和OPO技术。
优化的检测效率：TriM Scop可以支持最多达8个 non-descanned PMT, NDD可以是cooled generation III GaAsP PMT或者APD detector可以多传输40%效率的量子。
OPO技术– 红光和蛋白的激发：经典的Ti:Sa激光器成像红光的能力是非常有限的，因为经典的激发波长是1125到1250 nm, 并不在Ti:Sa激光器的转换范围之类。OPO技术解决了这个问题，因为它能传输可调的fs激光脉冲到>1100 nm的范围。TriM Scope是唯一能够支持该技术的商业化的显微镜。
FRAP, Uncaging and Photo Activation：LaVision BioTec的ImSpector Pro软件支持了先进的扫描模式，并且支持用户在ms毫秒之内切换扫描区域。因此，TriM Scope 是研究光活化、光释放和光漂白（photo activation, uncaging and FRAP ）的理想完美工具。
| Mitochondria | Hela cells | human skin |
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| Biopsie of Lung | SHG & Red in Zebrafish | Image in Lung Slice |
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