CCK-8细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒
英文名称: Cell Counting Kit
型号:null    产品货号: CCK-8
价格:请致电:010-57128832,18610462672
品牌: 北京索莱宝

 

产品简介:

Cell Counting Kit 简称CCK 试剂盒,为MTT 法的替代方法,是一种基于WST(水溶性
四唑盐,化学名:2-(2-甲氧基-4-硝***基)-3-(4-硝***基)-5-(2,4-二磺基***)-2H-四唑单钠盐)的广
泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。
CCK 用途:药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验
 
操作说明:
一、制作标准曲线(测定细胞具体数量时)
1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,然后接种细胞。
2、按比例(例如:1/2 比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做3-5 个细
胞浓度梯度,每组3-6 个复孔。
细胞计数方法 MTT 法 XTT 法 WST-1 法 CCK 法
形成的formazan 的
水溶性
差 好 好 好
产品性状 粉末 2 瓶溶液 溶液 1 瓶溶液
使用方法 配成溶液后使用 现配现用 无需预制 无需预制
检测灵敏度 高 很高 很高 高
检测时间 较长 较短 较短 最短
检测波长 560-600nm 420-480nm 420-480nm 430-490nm
细胞毒性
高,细胞形态完全消
很低,细胞形态不变很低,细胞形态不变 很低,细胞形态不变
试剂稳定性 一般 较差 一般 很好
大批量样品检测 可以 非常适合 非常适合 非常适合
便捷程度 一般 便捷 便捷 非常便捷
3、接种后培养2-4 小时使细胞贴壁,然后加CCK 试剂培养一定时间后测定OD 值,制作出一
条以细胞数量为横坐标(X 轴),OD 值为纵坐标(Y 轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以
测定出未知样品的细胞数量(试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致,便于确定细胞的
接种数量以及加入CCK 后的培养时间。)
二、细胞活性检测
1、在96 孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养(在37℃,5% CO2
的条件下)。
2、向每孔加入10 μL 的CCK 溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD 值的读数)。
3、将培养板在培养箱内孵育1-4 小时。
4、用酶标仪测定在450nm 处的吸光度。
5、如果暂时不测定OD 值,打算以后测定的话,可以向每孔中加入10 μL 0.1M 的HCL 溶液
或者1% w/v SDS 溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24 小时内吸光度不会发生
变化。
三、细胞增值-毒性检测
1、在96 孔板中配置100μL 的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24 小时(在37℃,5% CO2
的条件下)。
2、向培养板加入10μL 不同浓度的待测物质。
3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如:6、12、24 或48 小时)。
4、想每孔加入10μL CCK 溶液(注意不要再孔中生成气泡,它们会影响OD 值的读数)。
5、将培养板在培养箱内孵育1-4 小时。
6、用酶标仪测定在450nm 处的吸光度。
7、如果暂时不测定OD 值,打算以后测定的话,可以向每孔中加入10 μL 0.1M 的HCL 溶液
或者1% w/v SDS 溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24 小时内吸光度不会发生
变化。
注意:如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK 之前更换新鲜培养基(除去培养基,
并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小的情
况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
备注:
①建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK 试剂后的培养时间。
②有条件的情况下建议采用多通道移液器,可以减少平行孔减的差异。加入CCK 试剂时,建
议斜贴着培养板壁加,不要插到培养基页面下加,容易产生气泡,会干扰OD 值读数。
③白细胞可能需要培养较长时间。
④当使用标准96 孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μL 培养基)。检测
白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μL 培养基)。如果要使
用24 孔板或6 孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入
CCK 溶液。
⑤如果没有450nm 的滤光片,可以使用吸光度在430-490 nm 之间的滤光片,但是450nm 滤光
片的检测灵敏度最高。
⑥培养基中酚红的吸光度可以在计算时,通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会
对检测造成影响。
活力计算:
细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0 加药)-A(空白)] ×100
A(加药):具有细胞、CCK 溶液和药物溶液的孔的吸光度
A(空白):具有培养基和CCK 溶液而没有细胞的孔的吸光度
A(0 加药):具有细胞、CCK 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
*细胞活力:细胞增殖活力或细胞毒性活力
保存条件:
4℃干燥避光保存,有效期一年。
 
 

择进行试验。。。。 B. .. 全过程及所需试剂要求无菌环境 B. 全过程及所需试剂要求无菌环境 全过程及所需试剂要求无菌环境。。。。 剪碎法::::将组织块放入平皿后,加入少量组织匀浆液及 20%胎牛血清;用眼科剪将组织剪至匀浆状,加入 5ml 组织匀浆液及 20%胎牛血清;用吸管吸取组织匀浆,用 100 目不锈钢滤网(另购)过滤到试管内;离心沉淀 1500转/分×3 min,再用细胞洗涤液清洗 3次,每次以 500rpm短时低速离心除去细胞碎片,以 200 目不锈钢滤网(另购)过滤去细胞团块。作细胞计数并调整细胞浓度为(2~5)×107个/ml。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用 20%胎牛血清或全血及组织稀释液悬起细胞浓度为 2×108-1×109个/ml 的单细胞悬液备用。 匀浆器法:用眼科剪将组织剪成小块;放入 70ml 组织研磨器内,加入 2ml 组织匀浆液及 20% 匀浆器法胎牛血清;缓慢转动研棒,研磨至匀浆;用 5ml 组织匀浆液及 20%胎牛血清冲洗研器;收集细胞悬液,经 200 目不锈钢滤网(另购)过滤;离心沉淀 800rpm×2min ,再用细胞洗涤液洗 3 次,离心沉淀。作细胞计数并调整细胞浓度为(2~5)×107个/ml。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用 20%胎牛血清或全血及组织稀释液悬起细胞浓度为 2×108-1×109 个/ml 的单细胞悬液备用。 细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用计数板(血球计数板)进行。既可用于分离(散)细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,也可用于对培养物的细胞数量进行计数。不论计数的对象如何,均须制备分散的细胞悬液。 计数与计算过程 1)、在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片。 2)、用玻璃虹吸管吸取细胞,让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹处流出悬液,至盖玻片被液体充满为止。 3)、置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线者,对于细胞团按单个细胞计数。 4)、按下式计数细胞悬液的密度: 细胞密度=(4 个大格细胞总数/4)×104个/ml×稀释倍数 公式中乘以 104因为计数板中每一个大格的体积为: 1.0mm(长)×1.0mm(宽)×0.1mm(高)=0.1mm3 而 1ml=1000mm3细胞计数要点: 细胞计数要点::: A. 进行细胞计数时,要求悬液中细胞数目不低于 104个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中;显微镜下计数时,遇到 2 个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算。如果细胞团>10%,说明细胞分散不充分; 或细胞数<200 个/10mm2或>500 个/10 mm2 时,说明稀释不当,需重新制备细胞悬液。 B. 要求细胞悬液中的细胞分散良好,否则影响计数准确性。 C. 取样计数前,应充分混匀细胞悬液,尤其是多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀,以求计数准确; D. 数细胞的原则是只数完整的细胞,若细胞聚集成团时,只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时,则只计上线,不计下线,只计左线,不计右线。 E. 操作时,注意盖玻片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边槽?,否则要重新计数。 ?学者易犯的错误: 初学者易犯的错误::: A. 计数前未将待测悬液吹打均匀。 B. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。 C. 滴入悬液时的量太多,至使细胞悬液流入旁边的槽中。