• 通用- 不同的氨基反应性的双吖丙***衍生物可捕获特异的细胞内或细胞表面的蛋白质相互作用

• 可控制- 使用普通的实验室紫外灯即可激活两步化学交联

• 可逆- 含有二硫键的间隔臂可被还原剂剪切

• 简便- 在普通的实验室照明条件下试剂具有光稳定性，因此无需在黑暗中进行实验

• 优于芳香叠氮化物- 双吖丙***光反应基团具有更好的光稳定性，且可被长波紫外光更有效地活化

 

        在捕获蛋白质相互作用时，双功能性氨基或巯基反应交联剂需要两种蛋白质上的特定氨基酸基团（例如，赖氨酸或半胱氨酸）具有适当的间距。SDA 交联剂通过使用氨基反应活性的N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS ester）对一种蛋白质进行特定标记，然后使用紫外线活化将双吖丙***交联于第二种蛋白质的任意氨基酸侧链或肽段骨架上，从而避开了这一限制。基于双吖丙***的光交联剂较基于***基叠氮化物的光交联剂具有更好的光稳定性，并且易于被长波紫外光（330-370nm）活化。

        N- 羟基琥珀酰亚胺酯双吖丙***(NHS-ester diazirine) 衍生物（SDA，LC-SDA 和SDAD）缺少带电基团，因此具有膜通透性。此特性使其适于用于细胞内和膜内交联。相反，Sulfo-SDA，Sulfo-LC-SDA 和Sulfo-SDAD 含有带负电荷的硫酸根基团，改善了其水溶性并降低了其膜通透性，因此可将其用于细胞外蛋白质的交联。SDAD 和Sulfo-SDAD 的间隔臂中还含有一个二硫键，可被还原剂剪切。

使用NHS-Diazirine 进行细胞内和细胞外蛋白质的光反应***联为了证明使用SDA 试剂将细胞内蛋白质复合体进行光反应***联，我们检测了HeLa 细胞中有关早期内吞体抗原1(early endosome antigen, EEA1）蛋白的蛋白质相互作用。EEA1 通过卷曲螺旋结构域(coiled coil domain) 形成同源二聚体，结合到***脂囊泡上, 参与内吞体的运输。细胞用各种NHSDiazirine衍生物孵育并用紫外光处理。然后将细胞裂解并进行SDS-PAGE 分析，使用抗-EEA1 抗体进行Western blotting 分析。暴露于紫外线后，EEA1 迁移率降低的形式仅在SDA 和SDAD 处理的样品中检测到，而在模拟处理对照样品中未检测到（如图）。

        由于EEA1 是细胞内蛋白质复合体，它不会被不透细胞膜的Sulfo-SDA 交联。此外，具有更低迁移率的、SDAD- 交联的EEA1 可被还原剂二硫苏糖醇（dithiothreitol, DTT）在间隔臂内剪切。为了说明细胞膜蛋白质交联，我们对比了使用可逆的磺化的N- 羟基琥珀酰亚胺- 双吖丙***（Sulfo-SDAD），磺化的***基叠氮化物交联剂（sulfonated phenyl azide, Sulfo-SANPAH）或同源双功能N- 羟基硫代琥珀酰亚胺酯（BS3）处理细胞后异二聚体钠/ 钾（Na/K）ATPase 的交联情况。样品使用ThermoScientific Pierce BCA 蛋白质定量试剂盒标准化蛋白质含量，并且使用抗GAPDH 的抗体检测以表明等量上样。暴露于紫外线后，通过Western Blotting 观察，使用Sulfo-SDAD 处理的样品比使用Sulfo-SANPAH 或BS3 处理的样品明显具有更多的细胞表面Na/Kβ链交联产物（图示）

 

Bomgarden, R., et al. (2007). Previews11(2),16-18.

Hermanson, G.T. (2008). Bioconjugate Techniques, 2nd ed., Elsevier

IncSuchanek,M.,et al. (2005). Nat. Methods.2(4),261-267.

Tanaka, Y. and Kohler, J. (2008). JACS.10.1021/ja7109772.