革兰氏阳性菌质粒小量提取试剂盒 英文名称: 革兰氏阳性菌质粒小量提取试剂盒 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
型号:null 产品货号: 无 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
价格:请致电:010-57128832,18610462672 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
品牌: solarbio | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
革兰氏阳性菌质粒小量提取试剂盒 产品内容:
使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶体上的标签。溶液Ⅰ在使用前先加入 RNaseA(将试剂盒中提供的 RNaseA 全部加入) ,混匀,置于 2-8℃保存。如非指明,所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
操作步骤: 1、取 1-5ml 细菌培养物,12000rpm离心 1min,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。 2、向留有菌体沉淀的离心管中加入 200ul 溶液Ⅰ(请先检查是否已加入 RNaseA), 使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。再向其中加入 50ul 溶菌酶,混匀。37℃水浴 30 min 以上(根据菌液量可适当加长水浴时间)。注意:如果菌块未彻底混匀,会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。如不能确定为何种菌,请按阳性菌处理。 3、向离心管中加入 250ul 溶液Ⅱ,温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解。注意:混匀一定要温和,以免污染基因组 DNA,此时菌液应变得清亮粘稠,作用时间不要超过 5 min,以免质粒受到破坏。 4、向离心管中加入 350ul 溶液Ⅲ,立即温和地上下翻转 6-8 次,充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀。 11000rpm离心 10 min 。注意:溶液Ⅲ加入后应立即混匀,避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。 5、将上一步所得上清液加入吸附柱中(吸附柱加入收集管中),室温放置 2min,12000rpm 离心 1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中( 如果一次加不完,可分两次吸附) 。 6、向吸附柱中加入 700ul 漂洗液( 使用前请先检查是否已加入无水乙醇) ,12000rpm 离心 1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。 7、向吸附柱中加入 500ul 漂洗液,12000rpm离心 1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。 8、12000rpm 离心 2min,将吸附柱敞口置于室温或 50℃温箱放置数分钟,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR 等。 9、将吸附柱放入一个干净的离心管中,向吸附膜中央悬空滴加 50-200ul 经65℃水浴预热的洗脱液,室温放置2min,12000rpm离心 1min,收集质粒DNA溶液。 10、(可选)为了增加质粒的回收率,可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中,室温放置2min, 12000rpm离心 1min。 注意事项: 1、使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊,如有混浊现象,可在 37℃水浴中加热几分钟,待溶液恢复澄清后再使用。 2、洗脱缓冲液体积不应少于 50ul,体积过小影响回收效率;洗脱液的 pH 值对洗脱效率也有影响,若需要用水做洗脱液应保证其 pH值在 8.0 左右( 可用 NaOH 将水的 pH值调至此范围) ,pH值低于 7.0 会降低洗脱效率。DNA产物应保存在-20 ℃,以防 DNA 降解。 3、如果所提质粒为低拷贝质粒或大于 10kb 的大质粒,应加大菌体使用量,使用 5-10ml 过夜培养物,同时按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量,吸附和洗脱时可以适当的延长时间,以增加提取效率。 4、 DNA浓度及纯度检测:得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。得到的DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰,OD260值为 1 相当于大约 50 μg/ml 双链DNA、40 μg/ml 单链DNA。OD260/OD280比值应为 1.7-1.9 ,如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用去离子水,比值会偏低,因为pH值和离子存在会影响光吸收值,但并不表示纯度低。 相关产品: E1020 EB 染色液 D1010 6×DNA Loading Buffer T1060 50×TAE 缓冲液 T1050 5×TBE 缓冲液 M1060 D2000 DNA Ladder M1400 1kb DNA Ladder G8142 GoldView II型核酸染色剂(5000×) L1015 LB 固体培养基(干粉) L1020 SOC液体培养基(干粉) 相关试剂盒:
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