Wehelp （Golden）SYBR Mixture是专用于染料法（SYBR Green Ӏ）实时荧光定量PCR的预混体系，浓度为2×，包含（Golden）Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、SYBR Green Ӏ荧光染料和Mg²⁺。配制好的预混合液操作简单便捷、能有效缩短操作时间，减少移液过程中混入的污染。

SYBR Green Ӏ是一种结合于dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的荧光染料SYBR Green Ӏ与dsDNA 结合荧光信号会增800-1000倍，是一种常用的qPCR荧光染料。该染料性价比高、操作简便，具有高灵敏度、信噪比高等优势，可应用于基因表达差异分析，基因芯片等。Molebio-005中使用全新高效的热启动酶Golden Taq DNA Polymerase与Wehelp改良配制的缓冲体系，Golden Taq DNA Polymerase在常温下没有聚合酶活性，有效避免了在常温条件下由引物和模板非特异性结合或引物二聚体而产生的非特异性扩增，能显著提高扩增效率，PCR反应的灵敏度更高、特异性更强。

 

优点

Ø 配制好的预混合液中只需加入模板、 引物、灭菌水便可进行 Real Time PCR 反应，操作简单方便。

Ø 适用于荧光定量PCR检测，能够准确地对目的基因进行定量和检测。

Ø SYBR Green Ӏ 染料经济实惠，使用方便，灵敏度高、信噪比强。

 

注意事项

Ø -20℃避光保存，防止污染。

Ø 使用前，将产品室温下解冻，并轻轻涡旋混匀，解冻后所有实验应在冰上操作。 

Ø 避免反复冻融，反复冻融可能使产品性能下降。

Ø 在荧光定量PCR仪上进行实时PCR，并在退火或延伸步骤记录荧光信号。

 Ø 本产品未添加ROX校正染料。

Ø 本产品不能用于探针法荧光定量PCR。

 

使用指导

1、PCR反应体系

试剂	50 μl 反应体系	终浓度
2× Golden SYBR  Mixture	25 μl	1×
10 μM Forward Primer	1 μl	0.2 μM (0.05-1 μM)
10 μM Reverse Primer	1 μl	0.2 μM (0.05-1 μM)
Template DNA	2 μl
ddH2O	to 50 μl

 

2、PCR循环反应条件

步骤	循环次数	温度	时间
1	1	96℃	2分
2	35~40	95℃	15 秒
		60~64℃ (信号采集点)	1分
3	1 (熔解曲线)	95℃	15秒
		60℃	1分
		95℃	15秒
		60℃	15秒

注意：1）为抑制非特异性反应，Molebio-005中添加了抗 Taq DNA 多聚酶的单克隆抗体进行热启动。此方法的优点是酶活力的释放极快，在 2分钟内即可完成预变性。各循环的变性步骤只需考虑核酸变性所需的时间进行设定即可。如果使用 LightCycler^TM等高速 PCR 仪，更能显示出其缩短时间的优越性。

 

反应条件优化

u 引物浓度：一般以引物浓度0.2 μM为最佳浓度，终浓度0.05-1.0 μM为参考范围。降低引物浓度提高反应特异性；增加引物的浓度提高扩增效率，优化反应体系。

u 退火温度：升高退火温度是常用的提高反应特异性的方法，以60-64℃作为参考范围。若因Tm值较低引起实验结果不佳，可采用三步法进行PCR扩增，退火温度的参考范围为56℃-64℃。

u 延伸时间：推荐使用两步法PCR，延伸时间设置为1 min。若提高扩增效率，可尝试增加延伸时间，或尝试三步法PCR。

 

三步法荧光定量PCR

步骤	循环次数	温度	时间
1	1	96℃	2分
2	35~40	95℃	15 秒
		56~64℃	30秒
		72℃ (信号采集点)	32秒
3	1 (熔解曲线)	95℃	15秒
		60℃	1分
		95℃	15秒
		60℃	15秒